木霉屬真菌拮抗金釵石斛病原菌的研究

邢詠梅，李向東，李莉，郭順星

木霉屬真菌拮抗金釵石斛病原菌的研究

邢詠梅，李向東，李莉，郭順星

目的考察石斛屬藥用植物內生真菌拮抗軟腐病的真菌。

方法將 179 株內生真菌進行金釵石斛軟腐病生物防治盆栽試驗，以獲得拮抗病原菌終極腐霉的內生真菌。將具有拮抗效果的真菌在 PDA 培養基中與終極腐霉進行雙重培養平皿對峙試驗并對其顯微形態進行觀察，利用 3,5-二硝基水楊酸法檢測真菌的 β-1,3 和 β-1,4 葡聚糖酶活性。

結果T. koningiopsis 與 T. rogersonii 在盆栽試驗和雙重培養平皿對峙試驗中對終極腐霉具有抑制作用。T. koningiopsis 與 T. rogersonii 菌絲將終極腐霉菌絲包圍并將其破壞；兩者 β-1,3 和 β-1,4 葡聚糖酶活性在所測試的 5 種真菌中最高。

結論T. koningiopsis 與 T. rogersonii 可有效抑制終極腐霉；由兩者分泌的 β-1,3 和 β-1,4 葡聚糖酶可能在破壞終極腐霉細胞壁方面發揮作用。T. koningiopsis 和 T. rogersonii可作為潛在的生防菌發揮拮抗終極腐霉作用。

石斛； 腐霉菌屬； T. rogersonii； T. koningiopsis

終極腐霉是農作物和經濟作物的重要致病卵菌[1]，對不同植物造成立枯病、軟腐病和莖腐病等疾病。終極腐霉導致的軟腐病在石斛發病情況已有報道[2]；而終極腐霉感染鐵皮石斛可能與病原菌直接穿透宿主植物細胞壁并分泌細胞壁降解酶類密切相關，從而導致宿主細胞壁逐步被降解[3-4]。

金釵石斛，一種附生型蘭科藥用植物，為著名觀賞花卉。它含有石斛堿、石斛酚等生物活性成分[5]。金釵石斛與鐵皮石斛共同被列入中華人民共和國藥典。目前，由于過度采挖以及缺乏有效的保護，導致金釵石斛處于瀕危狀態。而大規模的人工栽培又因其潮濕的生長環境，不可避免受到病原性卵菌（終極腐霉）的侵害。受到侵害后的植株葉片出現向葉柄彎曲，發病植株出現倒伏、死亡。

目前，化學殺菌劑對抗植物病原菌的應用，一方面使環境受到污染，另一方面又對人類的健康造成威脅。因此，植物病原菌的生物防治越來越受到人們關注。內生真菌廣泛存在于植物中，它們在賦予宿主植物抵御病原菌、昆蟲和食草動物方面發揮了重要作用[6]。木霉屬真菌已被報道用于 Pythium spp. 以及 Fusarium spp. 的生物防治[7]。然而，木霉屬真菌拮抗植物病原菌的機制尚不清楚，可能與其分泌細胞外水解酶或抗生素樣物質有關[8]。

在以往的研究中，我們從鐵皮石斛、金釵石斛、齒瓣石斛以及球花石斛等石斛屬藥用植物中分離得到 179 株內生真菌，并對這些內生真菌是否具有拮抗終極腐霉的活性進行篩選。發現在鐵皮石斛的盆栽試驗中，T. rogersonii 和 T. koningiopsis 具有拮抗終極腐霉的活性[2, 9]。然而，內生真菌對感染終極腐霉的金釵石斛是否具有拮抗作用目前報道較少。因此，本研究從 179 株內生真菌中對感染了終極腐霉的金釵石斛進行了病原菌生物防治的篩選。將在盆栽試驗中對終極腐霉具有良好拮抗活性的真菌分別與終極腐霉進行共同培養，并觀察兩者相互作用的形態學變化；同時利用 3,5-二硝基水楊酸（DNS）方法對 5 種真菌細胞外 β-1,3 葡聚糖酶以及 β-1,4 葡聚糖酶的活性進行檢測，旨在為珍稀瀕危藥用植物金釵石斛資源的保護以及軟腐病的生物防治提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物及真菌材料 本研究所用終極腐霉是分離自云南省西雙版納地區石斛栽培基地中的感染軟腐病的金釵石斛栽培苗[2]，病原菌 GenBank注冊號為：KP676026[3]。金釵石斛組培苗為本實驗室保存。179 種內生真菌分別分離自石斛屬藥用植物根、莖、葉、花、種子等部位，保存于中國醫學科學院藥用植物研究所真菌室。

1.1.2 主要儀器 Axio Imager A1 型光學顯微鏡購自德國蔡司公司；SP-752 紫外可見光分光光度計購自上海光譜儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 終極腐霉與內生真菌的培養 終極腐霉與179 株內生真菌于 PDA 培養基中培養 7 d。內生真菌從 PDA 培養基中轉接至麥麩鋸末固體培養基（鋸末與麥麩各 500 g，加 1 L 水混勻），將每100 g 混勻后的基質裝入圓柱形的玻璃瓶中，122 ℃高壓滅菌 120 min。每種內生真菌直徑為 8 mm 的生長旺盛的三片菌片轉接入上述培養基中，黑暗條件下培養 3 周。

1.2.2 179 株內生真菌在金釵石斛栽培試驗中與終極腐霉的拮抗活性篩選 首先將栗樹皮切成直徑約為 1 cm 的小塊，浸入水中 6 h，然后裝入直徑 8 cm，高 14 cm 玻璃瓶中，每瓶裝 2/3 體積，約 180 g，并加入 100 ml 自來水，122 ℃ 高壓滅菌 180 min。選用口徑為 10 cm，高度為 8 cm 的塑料花盆，以栗樹皮作為栽培基質，預先準備好無菌培養的金釵石斛組培苗，將株高均勻一致的組培苗自光培養室取出，于自然光照與溫度下不解開封口膜煉苗 2 周，以提高小苗適應性。煉苗后在自然條件下揭開封口膜，用鑷子自瓶中輕取出組培苗（注意不要損傷根部），流水沖凈附著在根部的培養基， 挑選葉片數在 5 ～ 7 片，株高 4 ～ 6 cm 的組培苗。

栽培時先用高壓滅菌的栗樹皮鋪滿塑料花盆的二分之一，實驗組在基質的中央加入 1 g 內生真菌麥麩鋸末固體接種劑，把 4 株組培苗栽到接種劑上，填滿樹皮完成栽培工作。盆栽苗放入可控日光溫室中，溫度維持在（20 ± 2）℃，濕度維持在75% ～ 90% 之間。栽種后噴水 1 次，以利于內生真菌的生長，3 d 后在組培苗的周圍放入直徑 1 cm病原菌 PDA 菌片 2 片，栽種后噴水 1 次，澆水，以后每 3 天噴水 1 次。以組培苗栽種 3 d 后只接直徑 1 cm 病原菌 PDA 菌片 2 片作為陽性對照，只接無菌麥麩鋸末固體培養基，正常生長的組培苗作為陰性對照。試驗重復 3 次，每種處理做 5 個重復，定期觀察金釵石斛的生長情況。

1.2.3 β-1,3 葡聚糖酶活性測定 將具有拮抗作用的真菌及同屬不同種的其他真菌共 5 種在PDA 培養基中與終極腐霉進行雙重培養平皿對峙試驗，并檢測這 5 種真菌的 β-1,3 和 β-1,4 葡聚糖酶活性。將每種真菌的 3 片菌片（直徑為 8 mm）裝入 200 ml 馬鈴薯土豆液體培養基（葡萄糖20 g/L，土豆浸出液 200 g/L）的 500 ml 三角燒瓶中，25 ℃ 黑暗條件下，120 r/min 振蕩培養 7 d。培養物以濾紙過濾后，4 ℃、10 000 r/min 離心 10 min，得到的上清液即為無細胞培養濾液。隨后將得到的無細胞培養濾液以 0.45 μm 濾器過濾，所得濾液做酶活性測定。

將海帶多糖溶解于 50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0）中，將 1 ml 0.2% 海帶多糖（w/v）加入至 50 mmol/L 醋酸鈉緩沖液（pH 7.0）中與 1 ml酶溶液在 50 ℃ 孵育 15 min[10]。將 250 μl 海帶多糖加入至 EP 管中，然后加入 250 μl 5 種真菌的培養濾液，反應 15 min 后，溶液轉移到比色杯，加入 2 ml DNS 溶液，加入去離子水，將體積補充至 5 ml，混合溶液煮沸 3 min，在 520 nm 波長測定吸光度。反應初的吸光度值設為對照，試驗重復3 次，每個處理設 10 個重復。酶活力單位定義為：在上述反應條件下，每分鐘水解 β-1,3 葡聚糖釋放出 1 μmol 葡萄糖所需要的酶量，即為一個酶活力單位，以 U/ml 表示。

1.2.4 β-1,4葡聚糖酶活性測定 纖維素溶解于50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0）中，檢測方法與β-1,3 葡聚糖酶活性測定方法大致相同。不同之處是反應時間為 60 min。試驗重復 3 次，每組設10 個重復。

1.2.5 雙重培養平皿對峙試驗 根據盆栽試驗中所篩選出來的對終極腐霉具有明顯拮抗作用的真菌進行雙培養平皿對峙試驗。按照文獻[11]方法進行。具有拮抗活性的真菌與終極腐霉分別培養，3 d后分別將每一種真菌與病原菌接種入同一平皿中培養。將活化后的病原菌和內生真菌 PDA 菌片（直徑 4 mm）相對放置于直徑為 9 cm 的 PDA平板上，距離 5 cm，邊距 2 cm，每個處理組做3 個重復[12]。數據均采集自對峙培養 72 h，具有拮抗活性的內生真菌而不出現明顯的抑制帶類群，即內生真菌對病原菌有覆蓋消化或重寄生類群。采用蔡司光學顯微鏡觀察結合抑制帶的方法確定病原菌被抑制程度。

2 結果

2.1 內生真菌在金釵石斛栽培試驗中與終極腐霉的拮抗活性篩選

培養 3 w 后，未加任何內生真菌及終極腐霉的陰性對照組，金釵石斛生長旺盛（圖 1A）；陽性對照組中的金釵石斛生長 7 d 即出現枯萎癥狀，瀕臨死亡（圖 1D），生長 14 d 金釵石斛苗已完全死亡；試驗組中除了 T. koningiopsis 和 T. rogersonii以外，大多數從石斛屬藥用植物分離得到的內生真菌在盆栽試驗中對終極腐霉無明顯拮抗活性；加入T. koningiopsis 和 T. rogersonii 兩種木霉屬真菌的金釵石斛生長旺盛，與陰性對照組生長狀況類似，兩種木霉屬真菌對終極腐霉具有明顯的拮抗作用（圖 1B，1C）。

圖 1 內生真菌對金釵石斛盆栽試驗中終極腐霉的拮抗作用（A：不加內生真菌和終極腐霉的陰性對照組；B：實驗組加入T. koningiopsis 后對終極腐霉具有明顯拮抗作用；C：實驗組加入 T. rogersonii 后對終極腐霉具有明顯拮抗作用；D：只加入終極腐霉不加入內生真菌的陽性對照組）Figure 1 Antagonistic effects of the endophytic fungi on P. ultimum in pot experiment of D. nobile Lindl. Seedlings (A: D. nobile Lindl. seedlings in the control group grew normally without endophytic fungi or P. ultimum; B: T. koningiopsis showed even greater antagonistic activity than T. erinacecem on P. ultimum and the plant grew even better; C: T. rogersonii could also prevent damage from P. ultimum and D. nobile Lindl. seedlings grew exuberantly; D: The growth condition of D. nobile Lindl. seedlings a week after P. ultimum was inoculated)

2.2 β-1,3 葡聚糖酶和 β-1,4 葡聚糖酶活性

在所測試的 5 種木霉屬真菌中，以T. koningiopsis 酶活性最高，其中 β-1,3 葡聚糖酶活性為（7.87 ± 0.06）U/ml，β-1,4 葡聚糖酶活性為（10.35 ± 0.04）U/ml；其次是 T. rogersonii 酶活性較高；而 T. viride、T. gamsii 和 T. intricatum 的兩種葡聚糖酶活性較低，以 T. intricatum 為對照，T. koningiopsis 和 T. rogersonii 的酶活性與之相比，具有顯著性差異（P ＜ 0.05）（表 1）。

表 1 5 種木霉屬真菌細胞外酶活性Table 1 Extracellular enzymatic activities of five Trichoderma species

2.3 雙重培養平皿對峙實驗

T. koningiopsis 和 T. rogersonii 兩種具有拮抗活性的真菌的菌絲及分生孢子形態分別見圖 2A和圖 2B，終極腐霉的菌絲形態見圖 2E。終極腐霉（圖 2C 和圖 2D 白色箭頭，圖 2F 箭頭）與兩種拮抗菌共同培養 48 h 后，T. koningiopsis 和T. rogersonii 菌絲卷曲交錯，類似網狀（圖 2C 星號），然后將終極腐霉環繞包圍，終極腐霉菌絲被部分破壞（圖 2C 和圖 2D 白色箭頭）。

3 討論

目前報道較多的植物病害生防內生真菌是木霉屬真菌（Trichoderma spp.），木霉屬真菌是一類分布廣、繁殖快、具有較高生防價值的真菌，它對多種病原物都有抑制作用，是一類理想的防治土傳病害的生防真菌[13]。在本研究中，T. koningiopsis 和T. rogersonii 不僅在金釵石斛盆栽試驗中對終極腐霉具有較強的拮抗活性，在雙培養平皿對峙試驗中，這兩種真菌同樣對終極腐霉表現出了抑制活性。已報道木霉屬真菌對病原菌 Sclerotium rolfsii、Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum、F. culmorum 和 Phythium aphanidermatium 所致疾病具有拮抗作用[14]。

T. koningiopsis 和 T. rogersonii 在雙重培養平皿對峙實驗時表現出良好的拮抗終極腐霉的活性，其拮抗特點是沒有明顯的拮抗帶，但病原菌終極腐霉的生長受到抑制或消亡，隨著雙重培養時間的延長，病原菌菌絲體逐漸被消化和吸收，光學顯微鏡觀察可見病原菌被拮抗菌包繞，出現大量空泡，顯示出被消化分解的現象（圖 2），最終病原菌菌絲體細胞壁被分解而消亡，顯微鏡下檢測不到病原菌菌絲。T. koningiopsis 和 T. rogersonii 在所測試的5 種木霉屬真菌中 β-1,3 葡聚糖酶和 β-1,4 葡聚糖酶活性遠比其他 3 種木霉屬真菌高。木霉屬真菌產生的細胞外酶活性可能與其拮抗機制關系密切[10]。研究發現，木霉屬真菌對抗植物病原菌是通過分泌分解酶如幾丁質酶和 β-1,3 葡聚糖酶而實現的[15]。因此 T. koningiopsis 和 T. rogersonii發揮拮抗活性很可能與其分泌 β-1,3 葡聚糖酶和β-1,4 葡聚糖酶有關。在我們以往的研究中發現，T. koningiopsis 是分離自 D. devonianum 中的內生真菌，同時對金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌具有明顯的抑制活性[12]。本研究的試驗結果將會對金釵石斛生物防治提供新的理論依據。

圖 2 雙重培養平皿對峙實驗觀察終極腐霉和兩種木霉屬真菌形態特征[A：T. rogersonii 培養 48 h 菌絲及分生孢子；B：T. koningiopsis 培養 48 h 菌絲及分生孢子；C：T. rogersonii（黑色箭頭所示），終極腐霉菌絲（白色箭頭所示）；D：T. koningiopsis（黑色箭頭所示），終極腐霉菌絲（白色箭頭所示）；E：終極腐霉培養 24 h；F：T. rogersonii (T.k) 或 T. koningiopsis (T.r) 與終極腐霉（箭頭所示）共同培養 48 h；比例尺：10 μm]Figure 2 Confrontation between P. ultimum and the two Trichoderma sp. strains [A: The hyphae and spore of T. rogersonii growing for 48 h; B: The hyphae and spore of T. koningiopsis growing for 48 h; C: T. rogersonii (black arrow) and P. ultimum mycelium (white arrow); D: T. koningiopsis (black arrow) and P. ultimum mycelium (white arrow); E: P. ultimum mycelium growing for 24 h; F: Interactions between T. rogersonii (T.k) or T. koningiopsis (T.r) and P.ultimum (arrows) for 48 h; Scale bar: 10 μm]

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Studies on antagonism of Trichoderma sp. against pathogenic fungus of Dendrobium nobile Lindl.

XING Yong-mei, LI Xiang-dong, LI Li, GUO Shun-xing

ObjectiveTo investigate the effects of the growth inhibition between P. ultimum and the potential biocontrol agents which have been isolated from Dendrobium species of medicinal plant.MethodsAntagonistic effects of 179 endophytic fungi on P. ultimum in D. nobile Lindl. Seedlings in pot experiment were performed. In addition, the acitivities of β-1,3 glucanase and β-1,4 glucanase of 5 Trichoderma fungi in cell free filtrate were detected. The dual culture confrontation experiment between the antagonistic fungi and P. ultimum were also studied and the characteristics of the pathogen and the fungi with biocontrol activities were observed under light microscope.ResultsT. koningiopsis and T. rogersonii showed inhibitory effects on P. ultimum after cocultured with D. nobile Lindl. seedlings in pot experiment. The highest activity of β-1,3 glucanase and β-1,4 glucanase was produced by T. koningiopsis, which was followed by T. rogersonii. P. ultimum was damaged due to hyperparasitism by the two Trichoderma fungal strains.ConclusionAfter cocultured with D. nobile Lindl., T. koningiopsis and T. rogersonii could effectively antagonize P. ultimum in pot experiment. The enzymes of β-1,3 glucanase and β-1,4 glucanase produced by Trichoderma species might be involved in destruction of P. ultimum cell wall during antagonism. T. rogersonii and T. koningiopsis could be used as potential biocontrol agents.

DENDROBIUM LOODIGESII; Pythium; T. rogersonii; T. koningiopsis

GUO Shun-xing, Email: sxguo1986@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.007

Chin Med Biotechnol, 2017, 12(1):35-39

山西省煤基重點科技攻關項目（FT2014-03）；河北省科技計劃項目（16232503D）

100193 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室（邢詠梅、李向東、郭順星）；042400 山西省臨汾市古縣農業委員會（李莉）

郭順星，Email：sxguo1986@163.com

2016-12-01

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2017, 12(1):35-39

Author Affiliations:Key Laboratory of Bioactive Substances and Resource Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China (XING Yong-mei, LI Xiang-dong, GUO Shun-xing); Agriculture Committee of Guxian Country, Linfen, Shanxi 042400, China (LI Li)

www.cmbp.net.cn