基于DO-stat流加培養控制的海藻糖合成酶發酵條件研究

段瑩瑩，曹大鵬，任 峰，張曰輝，趙 偉*

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

基于DO-stat流加培養控制的海藻糖合成酶發酵條件研究

段瑩瑩，曹大鵬，任 峰，張曰輝，趙 偉*

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

溶氧濃度對重組大腸桿菌的生長和外源蛋白的高效表達影響較大，為進一步增加菌體量和重組蛋白表達量，該研究采用DO-stat流加培養進行控制，分別研究了溶氧濃度20%、30%、35%和40%條件下大腸桿菌的生長情況以及海藻糖合成酶的表達情況。結果表明，當發酵罐中溶氧濃度控制在30%時，發酵40 h，菌體干質量可達53.9 g/L，是分批發酵時的6倍，海藻糖轉化率達到80.9%，是分批發酵時的2.25倍。

高密度發酵；DO-stat；海藻糖合成酶

海藻糖（trehalose）是一種二糖，由兩個葡萄糖分子通過α-1,1-糖苷鍵連接而成，作為一種添加劑、穩定劑和甜味劑已經廣泛應用于食品、化妝品和醫藥工業等領域[1-2]。海藻糖目前的生產方法主要為酶法，其中較為簡便的海藻糖生產方法[3]是利用海藻糖合成酶的分子內轉糖基化作用將麥芽糖轉化為海藻糖。

生產大腸桿菌（Escherichia coli）或以其構建的基因工程菌的表達產物時采用一般的發酵工藝，大腸桿菌的菌體生物量、蛋白表達量、代謝產物在發酵液中和菌體內的濃度都比較低，很難得到理想的生產效率。高密度發酵重組大腸桿菌可獲得較高的生物量，但對發酵條件的要求非常高。影響高密度發酵的因素非常多，如細胞生長所需要的營養物質、發酵過程中積累的生長抑制物、培養溫度、溶氧濃度、發酵液的pH值、補料方式、誘導方式等。

在大腸桿菌的高密度發酵過程中，培養液中的溶氧量對大腸桿菌生長過程中的調控具有重要的作用[4]，能很好的反應大腸桿菌的生長狀態。DO-stat流加培養控制的基本原理是將由于底物缺失造成的溶氧濃度上升作為補加底物的信號[5]，是應用較多的一種反饋控制方式。重組大腸桿菌發酵過程中溶解氧濃度過高或過低均會抑制菌體的生長代謝，不利于產酶，為進一步增加海藻糖合成酶的表達量，提高海藻糖的轉化率，采用了DO-stat法用溶氧濃度作為反饋指標來流加營養物質的發酵方式[6]。當發酵液中的底物消耗到一定程度時，細胞由于營養缺失而耗氧下降導致溶氧濃度迅速上升，但是，通過補加底物，溶氧濃度又開始下降[7]。通過這種方式，可以維持溶氧濃度在一個恒定的水平。胡沛臻等[8]采用了溶氧反饋-補料分批技術在培養基因重組工程菌E.coliBL21/pET-MHM的過程中并取得了很好的效果，菌體的密度達到了70 g/L以上，目的蛋白的表達量＞菌體蛋白總量的38%。KORZ D J等[9]通過溶氧值的變化情況進行補料控制高密度培養大腸桿菌發酵過程，在補料培養階段大腸桿菌始終處于碳源限制性生長的狀態，保持著恒定的比生長速率，大腸桿菌的最終菌體密度達到148 g/L。本研究利用DO-stat流加控制方式探討了不同溶氧濃度對重組海藻糖合成酶工程菌的發酵過程的影響，研發出了穩定高效的高密度發酵工藝，為海藻糖工業化生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

大腸桿菌（E.coli）：山東福洋生物科技有限公司。

1.1.2 培養基

種子培養基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，氨芐西林鈉0.01%，pH 7.0。

發酵培養基：葡萄糖2%，NaH2PO40.3%，K2HPO41%，MgSO4·7H2O 0.12%，NH4Cl 0.1%，CaCl20.001%，玉米漿0.2%，氨芐西林鈉0.01%，pH 7.0。

1.1.3 試劑

海藻糖標準品：美國Sigma公司；乙腈（色譜純）：西隴化工股份有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、酵母粉、蛋白胨：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖：山東西王糖業有限公司；氯化鈉、氯化銨、氯化鈣、硫酸鎂：天津市河東區紅巖試劑廠；氨芐西林鈉：山東魯抗醫藥股份有限公司。

1.2 儀器與設備

15L發酵罐和過程參數檢測與控制系統：上海國強生化工程；PAS7000型生物尾氣分析系統：重慶哈特曼科技有限公司；Waters515泵、Waters2414型示差折光檢測器的高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國Waters公司；TP-114型電子天平：丹佛儀器有限公司；FE-20型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；AH-BASIC型勻漿機：ATS工業系統有限公司；DHZ-DA型冷凍恒溫振蕩器：太倉市實驗設備廠；SW-CJ-2D型凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養方法

將甘油保存液中保存的菌株以1%的接種量接到含有150 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，37℃、200 r/min振蕩培養6 h。

1.3.2 分批發酵培養方法

15 L全自動發酵罐，裝液量10 L，接種量10%，接種前發酵罐內加入氨芐西林鈉至100 μg/mL，設定發酵罐溫度37℃，空氣通量300 L/h，罐壓0.02 MPa，流加25%的氨水調節pH使其維持在7.0±0.2。

1.3.3 DO-stat流加控制培養方法

在分批培養的基礎上，當發酵液中的葡萄糖濃度下降且溶氧濃度上升時，通過蠕動泵自動向發酵罐內流加500 g/L的葡萄糖溶液。據報道，溶氧量維持在30%～40%[10]有利于重組大腸桿菌的生長和外源蛋白的高效表達，所以考察了20%、30%、35%和40%這幾個溶氧水平對重組海藻糖合成酶工程菌發酵過程的影響。

1.3.4 測定方法

菌體干質量：取不同發酵時間的菌液15mL，10000r/min離心10 min，蒸餾水清洗2次，105℃烘干至質量恒定，用微量分析天平稱量菌體干質量。

殘糖：采用斐林試劑法測殘糖含量，同一樣品做平行實驗3次。

殘糖含量（%）=[空白消耗葡萄糖溶液體積（mL）－樣品消耗葡萄糖溶液體積（mL）]×2×標準葡萄糖溶液的質量濃度（1 g/L）×樣品稀釋倍數

海藻糖轉化率：準確稱取轉化液1.000 0 g，超純水定容至100 mL，搖勻后超聲混勻20 min，進樣前用0.22 μm的濾膜過濾。HPLC測定轉化液中的海藻糖含量。

式中：C1為轉化液中海藻糖的含量，g/mL；C2為發酵底物中麥芽糖的含量，g/100g。

2 結果與分析

2.1 分批發酵培養方法

在分批發酵過程中，初始糖度為25 g/L，當發酵液中葡萄糖質量濃度＜10 g/L時，開始手動補加葡萄糖，使發酵液中葡萄糖濃度維持在10 g/L左右，其分批發酵過程曲線見圖1。

圖1 重組海藻糖合成酶工程菌分批發酵過程曲線Fig.1 Process curve of batch fermentation with trehalose synthase recombinant engineering strain

由圖1可知，0～8 h為菌體生長延遲期，此時菌體正慢慢適應外界環境，糖耗速率較慢，基本不產酸；9～22 h為菌體對數生長期，此時菌體的生長速率達到最大值并保持較大值，糖耗速率明顯加快，溶氧迅速下降，15 h時發酵液中葡萄糖質量濃度下降到最低值，此階段開始周期性補加葡萄糖；23～32 h為菌體減速生長期，25 h時加入乳糖降溫誘導表達海藻糖合成酶；33～40 h為細胞穩定生長期，此間糖耗速率減慢，溶氧回升，分批發酵結束，下罐后菌體干質量為8.85 g/L，海藻糖轉化率為35.9%。

2.2 DO-stat流加控制培養方法

2.2.1 不同溶氧量對菌體干質量的影響

從圖2可知，溶氧量對菌體干質量影響較大，發酵初期即菌體生長延遲期同分批發酵過程，控制不同溶氧水平后菌體生長差異較大。30%溶氧條件下菌體生長最快，明顯優于20%、35%和40%這三個溶氧水平，發酵40 h時，菌體干質量可達53.9 g/L。

圖2 不同溶氧量對菌體干質量的影響Fig.2 Effect of different dissolved oxygen concentration on cell growth

2.2.2 不同溶氧量對海藻糖轉化率的影響

圖3 不同溶氧量下產生的海藻糖合成酶隨時間的變化曲線Fig.3 Change curve of trehalose synthase at different dissolved oxygen concentrations

由圖3可知，發酵對數中期約25 h時加入乳糖降溫誘導表達海藻糖合成酶，不同溶氧濃度下海藻糖合成酶的表達量呈現出明顯的差異。當溶氧濃度控制在30%，發酵40 h時海藻糖轉化率最高，達到80.9%；溶氧濃度控制在20%、35%，發酵40 h時海藻糖轉化率分別為50.8%和39.8%；溶氧濃度控制在40%，發酵40 h時，其海藻糖轉化率最低，可能是發酵液中溶氧濃度過高或過低均不利于海藻糖合成酶的表達。

3 結論

通過DO-stat流加策略研究溶氧濃度20%、30%、35%和40%條件下大腸桿菌的生長情況以及海藻糖合成酶的表達情況，結果表明，當發酵罐中溶氧濃度控制在30%，發酵40 h時，菌體干質量可達53.9 g/L，是分批發酵（8.85 g/L）時的6倍，海藻糖轉化率達到80.9%，是分批發酵（35.9%）時的2.25倍。重組大腸桿菌發酵生產海藻糖合成酶過程中采用DO-stat流加培養控制方式，一方面可以更好地控制溶氧濃度，滿足菌體生長及代謝所需的溶氧水平，另一方面可以在較短的發酵時間內實現重組大腸桿菌的高密度高表達，為工業化生產海藻糖提供理論依據和技術支持。

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Research on trehalose synthase fermentation conditions based on DO-stat culture-feeding strategy

DUAN Yingying,CAO Dapeng,REN Feng,ZHANG Yuehui,ZHAO Wei*(Shangdong Fuyang Biotechnology Co.,Ltd.,Dezhou 253100,China)

Dissolved oxygen concentration has great effect on recombinantEscherichia coligrowth and high-efficiency expression of heterologous protein.In order to further increase the cell content and recombinantE.coliexpression,DO-stat feeding strategy was adopted.The effect of dissolved oxygen concentration(20%,30%,35%and 40%)onE.coligrowth and trehalose synthase expression were investigated respectively.Results showed that the cells dry mass reached 53.9 g/L,which was 6 times of those in fed-batch fermentation,the conversion rate of trehalose reached 80.9%,which was 2.25 times of those in fed-batch fermentation,when dissolved oxygen concentration was controlled at 30%for 40 h fermentation.

high density fermentation;DO-stat;trehalose synthase

TQ920.1

0254-5071（2017）01-0135-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.028

2016-08-10

段瑩瑩(1985-)，女，工程師，碩士，研究方向為微生物發酵。

*通訊作者：趙偉(1979-)，女，工程師，碩士，研究方向為微生物發酵。