蝦青素對微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦的生長、繁殖及免疫力的影響

安振華，王柳富，李晴

（揚州大學動物與科學技術學院，江蘇揚州 225009）

蝦青素對微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦的生長、繁殖及免疫力的影響

安振華，王柳富，李晴

（揚州大學動物與科學技術學院，江蘇揚州 225009）

本文目的旨在研究蝦青素對微囊藻毒素MC-LR脅迫下（25μg/L）克氏原螯蝦的免疫力及生長繁殖的影響。實驗設計四個梯度的飼料中蝦青素添加比例分別為（0、5、10、20mg/g）養(yǎng)殖周期持續(xù)8星期。結果表明蝦青素顯著提高了克氏原螯蝦肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）和堿性磷酸（AKP）的活力（P＜0.05）。5 g/kg蝦青素的添加量即可對SOD酶活具有明顯提升（P＜0.05）；10 g/kg的蝦青素添加量對AKP的提升最為明顯（P＜0.05）；研究還發(fā)現蝦青素可顯著提高微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦的存活率和特定生長率（SGR）（P＜0.05），提高克氏原螯蝦雌蝦的抱卵量。研究表明蝦青素作為一種抗氧化劑適宜于在克氏原螯蝦飼料中添加，并且具有提高蝦體免疫活力，緩解微囊藻毒素MC-LR對蝦體氧化脅迫的作用。

MC-LR；克氏原螯蝦；免疫指標；蝦青素

作為世界上散布最廣泛、最具侵略性的螯蝦[1]，克氏原螯蝦對極端環(huán)境有很強的耐受性，并且在水華經常爆發(fā)的一些水域也很容易存活[2]。有研究表明克氏原螯蝦可以以微小藻類為食，且會在它們的器官內蓄積藻毒素[3]。實地調查常發(fā)現，在含微囊藻毒素較多的水體中，克氏原螯蝦攝食雖然正常，但往往出現生長緩慢的問題。

微囊藻毒素被認為具有破壞生物體內氧化還原平衡的能力,除了抑制磷酸酶致毒外，氧化應激以及線粒體通透性轉換在MC致毒機制中也起著很重要的作用。MC可以誘導細胞內活性氧（ROS）產生，導致細胞損傷和脂質過氧化，并有可能通過某些通路誘導細胞凋亡。有研究表明微囊藻毒素在魚類和其他一些水生生物的器官或組織內隨著時間的增加，其含量會逐漸降低[4]。一些研究的結果顯示MC-LR在水生生物體內的蓄積和引起的脂質過氧化反應主要發(fā)生在肝臟中[5]，卵巢次之[6]，也許這就是生長于水華爆發(fā)的水體中的克氏原螯蝦繁殖力低的原因。

蝦青素（Astaxanthin），又名變胞藻黃素或蝦紅素，有著色、促進生長和增強免疫力的生物功能，并且是目前為止發(fā)現的抗氧化能力最強的物質之一，能夠有效清除細胞內的氧自由基的作用[7]。本項目期冀于研究在微囊藻毒素MC-LR脅迫下，通過飼料中添加蝦青素對克氏原螯蝦生長發(fā)育的影響，以探討蝦青素緩解微囊藻毒素MC-LR對克氏原螯蝦脅迫的機制，為克氏原螯蝦的高效、安全生產提供一定的技術支持和基礎理論依據。

1 材料及方法

1.1 試驗材料來源

本次實驗使用的克氏原螯蝦購自江蘇省揚州市市場，原產于揚州寶應市，選附肢齊全、健康活潑、規(guī)格一致的個體作為實驗蝦，并將其置于（15± 3）℃和自然光照環(huán)境中暫養(yǎng)一個月。飼料是由江蘇富裕達糧食制品有限公司生產的蝦用飼料，飼料成分表見表1。MC-LR購自北京伊普瑞斯科技有限公司，溶于純凈水后保存在冰箱內，在使用時直接按比例添加到玻璃箱中。蝦青素購自福建日冕科技股份有限公司，為單粒500 mg規(guī)格膠囊狀保存（能值34.5 kJ/g），每粒含蝦青素60 mg，膠囊內輔料為大豆油。使用時將膠囊刺破后與飼料混合拌勻。實驗投喂的各組飼料中因蝦青素添加量不同造成的能值差異，通過額外補充等能值的大豆油來平衡。

表1 飼料的能值及生化組成

1.2 實驗方法

本實驗設計四個蝦青素添加梯度，飼料中蝦青素添加梯度分別為0、5、10、20 mg/g，每個處理設3個重復，實驗共用蝦96只（20.6±7.5）g。每個重復設置為8只規(guī)格一致的克氏原螯蝦成蝦（4雌4雄，組間體質量無統計學意義差異），在溫室的玻璃水族箱中飼養(yǎng)（800 mm×600 mm×400 mm），微囊藻毒素的脅迫濃度25μg/L。同時設置一組水體中無MC-LR添加的空白組，空白組所投喂的飼料中無蝦青素添加。MC-LR購自北京伊普瑞斯科技有限公司，相關濃度測定使用北京金強環(huán)保公司ELISA試劑盒測定。

1.3 日常飼養(yǎng)管理

實驗前測定配制飼料的生化成分和能值。實驗中每天在8：00與18：00分兩次投喂已配置好的餌料。飼養(yǎng)水溫用加熱棒控制在（15±3）℃。每天換水量保持在水族箱容積的1/3，溶氧量保持在4.0mg/ L以上。換水時調節(jié)好不同水族箱中的MC-LR毒素的濃度，使其濃度保持恒定在25μg/L。每天記錄測定攝食和抱卵情況。若有死蝦則及時揀出，實驗結束時測量蝦體體長、體質量和懷卵量。

白鷲的速度比滑翔翼快著許多，沖在最前方的白鷲已然到達了戰(zhàn)場。它發(fā)出一聲狠厲的嘶鳴，身子向下俯沖，伸出鋼鉤一般的利爪，勾住了一條土狼的脊骨。它雙翅一振，帶著土狼沖天而起，飛到半空時，又松開利爪將土狼丟下。土狼驚恐地嚎叫著，重重摔在巖石上，叫聲戛然而止，它的身子也變成了軟趴趴的一坨爛肉。

1.4 實驗指標的測定

1.4.1免疫指標的測定每個水族箱中隨機抽樣取出4個樣本，取出每個樣本的肝胰腺，將不同重復組的肝胰腺分別放入研磨器中加入6mL的蒸餾水，按水族箱的編號對每個研磨器進行編號。將先研磨好的待測樣品插在冰盒里保存。取研磨好的樣品1.8 mL在型號為Centrifuge 5415R的離心機內離心后取上清液進行后續(xù)操作。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP）采用微量酶標法，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase SOD）采用的是WST-1法，所用的酶活測試試劑盒均來自南京建成生物工程研究所，蛋白濃度采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定，測定酶標儀型號為IMarkTM168-1130。

AKP=（測定OD值－空白OD值/標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（0.02mg/mL）÷待測樣品蛋白濃度（gprot/mL）

SOD抑制率=（（A對照－A對照空白）－（A測定－A測定空白））/（A對照－A對照空白）×100%

SOD活力=SOD抑制率÷50%×反應體系稀釋倍數0.24 mL/0.02 mL÷待測樣本蛋白濃度（gprot/ mL）。

1.4.2生長繁殖的測定①繁殖力：實驗結束時計算克氏原螯蝦的抱卵量。②特定生長率（Special growth rate SGR）SGR=（lnY2-lnY1）/t×100%，式中Y1、Y2分別表示實驗開始和結束時克氏原螯蝦的體質量。③存活率：存活率=終末存活尾數/初始存活尾數×100%。

2 結果與分析

由圖1可見，添加蝦青素可顯著提高脅迫組克氏原螯蝦肝臟中SOD的活力，其中5 g/kg蝦青素的添加量對SOD的提升最為顯著。10 g/kg以下的蝦青素添加量使得脅迫組的SOD活力遠大于未脅迫組并且SOD的活力隨著蝦青素的增加而增強。20 g/kg蝦青素的添加量時SOD活力明顯下降。

由圖2可見，10 g/kg以上蝦青素的添加量對脅迫組AKP活力提升最為明顯，且遠超未脅迫組AKP的活力，總體而言，添加蝦青素的脅迫組AKP活力均大于未脅迫組。

2.2 蝦青素對微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦生長繁殖的影響

由表2可見，脅迫下克氏原螯蝦的繁殖力低于未脅迫組，但隨著蝦青素的添加，脅迫組的平均抱卵量和相對抱卵量都呈持續(xù)上升的態(tài)勢。

圖1 蝦青素對微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦體內SOD的影響

圖2 蝦青素對微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦體內AKP的影響

2.3 蝦青素對微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦特定生長率、成活率和餌料系數的影響

由表3可見蝦青素的添加對脅迫組的特定生長率、成活率影響顯著，添加量在10 g/kg時對SGR最大，且10 g/kg以上時，脅迫組的SGR大于未脅迫組。同時，蝦青素的添加顯著提高了脅迫組的成活率，由表3可看出20 g/kg的添加量時，脅迫組的成活率達到最大，但均未超過未脅迫組，且對餌料系數的影響不明顯。

3 討論

3.1 蝦青素對克氏原螯蝦生長發(fā)育的影響

在促進生長方面，呂玉華[8]等的研究表明，蝦青素能使羅氏沼蝦的質量增長率顯著提高14.48%，Petit[9]等發(fā)現，在飼料中添加蝦青素可縮短日本囊對蝦的蛻皮周期，促進生長。此外Medina[10]報道，當凡納濱對蝦仔蝦在低鹽度海水中生活時，投喂80 mg/ kg的蝦青素降低了蝦的呼吸代謝水平。這說明，蝦青素能使低鹽度脅迫的凡納濱對蝦降低了能量消耗，促進對蝦的生長。本實驗中蝦青素的添加不僅提高了克氏原螯蝦的特定生長率，同時提高了其存活率和繁殖力，這說明蝦青素不僅可以緩解微囊藻毒素MC-LR造成的機體氧化應激，同時可以緩解其在克氏原螯蝦體中的積累，尤其是在其蓄積的主要的靶器官-卵巢[6]中的積累。考慮到微囊藻毒素MC-LR的廣泛存在，通過在飼料中添加一定量的蝦青素，可能對提高養(yǎng)殖池塘中克氏原螯蝦的出苗量有一定幫助。

表2 蝦青素對微囊藻毒素MC-LR脅迫下克氏原螯蝦繁殖力的影響

3.2 蝦青素對克氏原螯蝦免疫力的影響

現有研究證實生物體內的抗氧化酶系統[如谷胱甘肽S轉移酶（GPS）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）]活性的降低，將會削弱機體的抗氧化防御能力[11]，從而影響生物正常的生長和呼吸功能，降低生長速度和免疫力[12]。而抗氧化劑（如N-乙酰半胱氨酸、硒等）可通過減少ROS生成和降低丙二醛（MDA）水平、保護抗氧化酶的活性，減輕細胞骨架破壞，從而有效預防和對抗微囊藻毒素引起的氧化應激反應，而蝦青素也正是這樣一種具有提高機體抗氧化系統活力，減輕氧化應激的物質，蝦青素同樣具有增強生物體對外界環(huán)境應激抵抗力的能力。

謝劍華[13]等在日本沼蝦研究中發(fā)現：蝦青素可提高日本沼蝦的免疫力。溫為康[14]等通過對飼料中添加蝦青素，發(fā)現蝦青素能顯著提高斑節(jié)對蝦的酚氧化酶活力，其活力隨蝦青素的添加量緩慢上升，160mg/kg是略有下降，蝦青素激活了酚氧化酶原系統。本實驗研究發(fā)現蝦青素的添加除了可以提高酚氧化酶活力外，也相應的提高了AKP和SOD的活力。這說明飼料中蝦青素的添加激活并提高了克氏原螯蝦體細胞內的整體抗氧化能力，提高了克氏原螯蝦機體免疫力。

Chien等[15]通過對墨吉對蝦幼體飼喂含蝦青素（80mg/kg）的飼料，然后將這些對蝦置入急劇變化的環(huán)境中（鹽度從32降到0或溫度從27℃降到5℃）持續(xù)5min，再分別測定實驗組（80mg/kg組）和對照組（0添加組）蝦體的平均恢復率。結果表明實驗組恢復率為對照組的1.17倍。另外還發(fā)現實驗中熱應激對蝦恢復率的影響遠大于滲透壓的影響，表明蝦青素可以增強墨吉對蝦對外界應激的抵抗能力。在本實驗中同樣發(fā)現一定量的蝦青素添加可以幫助克氏原螯蝦抵抗微囊藻毒素MC-LR帶來的氧化應激，由此可見提高水生生物體內的抗氧化酶系統活力對微囊藻毒素MC-LR引起的氧化脅迫具有一定的緩解作用，這為通過添加蝦青素緩解微囊藻毒素MC-LR對克氏原螯蝦造成的氧化脅迫提供了重要的理論依據。

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The effects of astaxanthin on imm unity，reproduction of Procambarus clarkii under M icrocystin-LR stress

An Zhenhua，Wang Liufu，LiQing
（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

This research aimed to study the effects of astaxanthin on immunity，reproduction of Procambarus clarkii undermicrocystin-LR（MC-LR）stress.The Procambarus clarkii were cultured under MC-LR stress（25 ug/L）and were fed with fodders containing astaxanthin（0，5，10，20 g/kg）for 8 weeks in glass tanks（800mm× 600 mm×400 mm）.The results showed that astaxanthin can significantly improve the activity of superoxide dismutase（SOD）and alkaline phosphatase（AKP）in liver of Procambarus clarkii（P＜0.05）.Astaxanthin can significantly improve the survival rate and specific growth rate（SGR）of Procambarus clarkii under MC-LR stress（P＜0.05）.The 10 g/kg contentof astaxanthin in fodder can be a practical and economic choice.

MC-LR；Procambarus clarkii；immune index；astaxanthin

Q175

：A

：1004-2091（2017）01-0030-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.01.007

2016-04-24）

江蘇省水產三新工程（Y2015-28）

安振華（1981-），男，講師，研究方向為水產動物生理.E-mail:anzhenhua@yzu.edu.cn