杜仲壯骨丸對維甲酸致小鼠骨質疏松的改善作用Δ

劉 明，宣振華，張永萍#，劉 毅，劉 莉，王海洋（1.貴陽中醫學院基礎醫學院，貴陽 55005；.貴陽中醫學院藥學院，貴陽 55005；.貴陽德昌祥藥業股份有限公司，貴陽 55000）

杜仲壯骨丸對維甲酸致小鼠骨質疏松的改善作用Δ

劉 明1＊，宣振華2，張永萍2#，劉 毅2，劉 莉3，王海洋3（1.貴陽中醫學院基礎醫學院，貴陽 550025；2.貴陽中醫學院藥學院，貴陽 550025；3.貴陽德昌祥藥業股份有限公司，貴陽 550002）

目的：考察杜仲壯骨丸（DZ）對小鼠骨質疏松的改善作用。方法：將72只KM小鼠隨機分為空白對照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽性對照組（仙靈骨葆膠囊，0.50 g/kg）和DZ高、中、低劑量組（1.90、0.95、0.48 g/kg，記為DZ-H、DZ-M、DZ-L組），每組12只。除空白對照組外，其余各組小鼠均ig維甲酸復制骨質疏松模型，并同時ig相應藥物，每天1次，連續14 d。末次給藥后，測定小鼠體質量；摘眼球取血測定血清鈣、血清磷含量；取肝、脾、胸腺測定臟器指數；取左側股骨測定骨濕質量、干質量、長度和直徑；取右側股骨測定骨小梁面積百分比、骨小梁寬度及數目。結果：與空白對照組比較，模型組小鼠體質量降低；血清鈣、血清磷含量增加；肝指數、脾指數升高，胸腺指數降低；股骨濕、干質量及直徑減少；骨小梁面積百分比降低，骨小梁寬度及數目減少，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠血清鈣含量減少，陽性對照組和DZ-M、DZ-L組小鼠血清磷含量減少；陽性對照組和DZ-M、DZ-L組小鼠胸腺指數升高，陽性對照組小鼠肝臟指數降低；陽性對照組小鼠的股骨濕質量及DZ-M組小鼠股骨干、濕質量和直徑均增加；陽性對照組和DZ-H、DZ-M組小鼠股骨骨小梁百分比升高，骨小梁寬度及骨小梁數目均增加，且DZ-L組小鼠骨小梁數目增加，以上差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結論：DZ對維甲酸致小鼠骨質疏松具有一定的改善作用。

杜仲壯骨丸；維甲酸；骨質疏松模型；小鼠；股骨計量學指標

維甲酸（Retinoic acid）是一種免疫抑制劑，由于其具有抑制骨合成的作用，近年來常被用來建立動物骨質疏松模型[1]。杜仲壯骨丸（DZ）是貴陽德昌祥藥業有限公司獨家專利品種（國藥準字號為Z52020210），臨床主要用于治療風濕痹痛、筋骨無力等癥。本品臨床應用多年，具有堅實的臨床基礎，但由于處方中含有豹骨和尋骨風2味藥材，其中豹骨屬于瀕危保護動物藥材，尋骨風由于含有馬兜鈴酸，長期大量應用可引起一定程度的腎損害。因此，本課題組在對這2味藥材進行減去或替代（即去掉豹骨，另用腫節風代替尋骨風，然后按照原制備工藝制備）研究的基礎上，采用維甲酸致小鼠骨質疏松，觀察改進后的DZ對小鼠骨質疏松的改善作用，以擴大其臨床適應證。

1 材料

1.1 儀器

752紫外光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠）；TGL-12GB-C臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；BX51T-PHD-J11系統相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；多功能真彩色細胞圖像分析管理系統（美國Media Cybernetics公司）。

1.2 藥品與試劑

DZ（貴陽德昌祥藥業有限公司，批號：20130906，規格：0.19 g/丸）；仙靈骨葆膠囊（貴州同濟堂制藥有限公司，批號：20130217，規格：每粒0.5 g）；維甲酸原料藥（全反式，重慶華邦制藥股份有限公司，批號：20130425）；血清鈣、磷試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20140327、20140329）。

1.3 動物

SPF級KM小鼠72只，♀♂各半，體質量24～28 g，由貴陽醫學院實驗動物中心提供[動物合格證號：SCXK（黔）2012-001]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將72只KM小鼠隨機分成6組，分別為空白對照組、模型組、陽性對照組（仙靈骨葆膠囊，0.50 g/kg，相當于人臨床用量的10倍劑量）和杜仲壯骨丸高、中、低劑量組（1.90、0.95、0.48 g/kg，分別相當于人臨床用量的20、10、5倍劑量，分別記為DZ-H、DZ-M、DZ-L組），每組12只。除空白對照組外，其余各組小鼠每天上午按105 mg/kg劑量ig維甲酸相應溶液1次，連續14 d，復制骨質疏松模型[2]。造模同時，各給藥組小鼠每天下午ig相應藥物，給藥體積均為0.2 mL/10 g（均以生理鹽水為溶劑），每天1次，連續14 d；空白對照組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水。實驗過程中每周稱小鼠體質量1次。

2.2 標本采集及指標檢測

[3-6]中方法進行標本采集與指標檢測。

2.2.1 血清鈣、血清磷含量及重要臟器指數 于實驗第15天摘眼球取血，以1 000×g離心15 min，分離血清，按照試劑盒說明書操作，檢測血清鈣、血清磷含量。取血完成后處死小鼠，取肝、脾、胸腺，稱質量，計算臟器指數：臟器指數（mg/g）＝臟器質量（mg）/體質量（g）。

2.2.2 骨小梁面積百分比、骨小梁寬度及數目 取右側股骨，中性福爾馬林浸泡，常規脫鈣，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后，通過多功能真彩色細胞圖像分析管理系統對骨小梁面積百分比、骨小梁寬度及骨小梁數目進行分析。

2.2.3 股骨計量學指標 取左側股骨，除凈附著的軟組織，測定股骨計量學指標。（1）股骨濕質量：用電子天平稱量，得股骨濕質量（mg）；（2）股骨長度：用游標卡尺進行測量，得股骨長度（mm）；（3）股骨直徑：分別于股骨的近端1/3點、中點、遠端1/3點，用游標卡尺量取最大外徑及最小外徑，取6個值的平均值，得股骨直徑（mm）；（4）股骨干質量：將股骨在80℃條件下烘干至恒質量，得股骨干質量（mg）。

2.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。實驗數據采用s表示，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 DZ對骨質疏松模型小鼠血清鈣、血清磷含量的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清鈣、血清磷含量增加（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清鈣、血清磷含量均不同程度地降低，除DZ-H組小鼠血清磷含量降低不顯著外，其余各組差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），結果見表1。

表1 各組小鼠血清鈣、血清磷含量測定結果（±s，n＝10）Tab 1 The serum calcium and serum phosphorus content of mice in each group（±s，n＝10）

表1 各組小鼠血清鈣、血清磷含量測定結果（±s，n＝10）Tab 1 The serum calcium and serum phosphorus content of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組模型組陽性對照組DZ-H組DZ-M組DZ-L組血清磷，mmol/L 2.778±0.756 3.663±0.895＊2.778±0.399##3.173±0.771 3.034±0.707#2.977±0.562#劑量，g/kg 0.50 1.90 0.95 0.48血清鈣，mmol/L 1.964±0.305 2.439±0.674＊1.994±0.254#1.984±0.368#1.998±0.182#2.031±0.125#

3.2 DZ對骨質疏松模型小鼠體質量及重要臟器指數的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠體質量、胸腺指數降低（P＜0.05或P＜0.01），肝指數和脾指數升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和DZ-M、DZ-L組小鼠胸腺指數升高（P＜0.05或P＜0.01），陽性對照組小鼠肝指數降低（P＜0.05），結果見表2。

3.3 DZ對骨質疏松模型小鼠股骨骨小梁的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠股骨骨小梁面積百分比降低（P＜0.01），骨小梁寬度和數目減少（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組上述指標均得到不同程度改善，除DZ-L組小鼠股骨骨小梁面積百分比和骨小梁寬度變化不顯著外，其余各組上述指標差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖1、表3。

3.4 DZ對骨質疏松模型小鼠股骨計量學指標的影響

表2 各組小鼠體質量及胸、肝、脾指數測定結果（±s，n＝12）Tab 2 The wight and thymus，liver and spleen indexes of mice in each group（±s，n＝12）

表2 各組小鼠體質量及胸、肝、脾指數測定結果（±s，n＝12）Tab 2 The wight and thymus，liver and spleen indexes of mice in each group（±s，n＝12）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05

組別空白對照組模型組陽性對照組DZ-H組DZ-M組DZ-L組劑量，g/kg 0.50 1.90 0.95 0.48體質量，g 33.3±2.9 29.9±3.9＊29.8±3.7 28.9±3.3 28.7±3.8 30.2±4.1脾指數，mg/g 3.2±0.5 3.9±0.9＊3.4±0.7 3.5±0.9 3.7±0.8 3.9±0.8胸腺指數，mg/g 3.8±0.7 2.9±0.5＊＊3.4±0.6#3.1±0.6 3.5±1.0#3.3±0.6#肝指數，mg/g 43.5±4.0 47.8±4.3＊43.9±6.1#44.9±5.6 46.6±4.6 48.6±5.5

圖1 各組小鼠股骨病理切片圖（HE染色，×100）Fig 1 Pathological sections of femour of mice in each group（HE staining，×100）

表3 各組小鼠股骨骨小梁面積百分比、骨小梁寬度及數目測定結果（±s，n＝8）Tab 3 The area percentage，width and number of bone trabecula of femur of mice in each group（±s，n＝8）

表3 各組小鼠股骨骨小梁面積百分比、骨小梁寬度及數目測定結果（±s，n＝8）Tab 3 The area percentage，width and number of bone trabecula of femur of mice in each group（±s，n＝8）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組模型組陽性對照組DZ-H組DZ-M組DZ-L組骨小梁數目，個/mm 8.8±1.8 2.3±0.7＊＊5.3±1.2##6.1±1.6##5.4±1.7##3.3±0.9#劑量，g/kg 0.50 1.90 0.95 0.48骨小梁面積百分比，% 31.8±8.1 5.1±1.4＊＊17.9±7.1##20.7±9.8##15.8±6.1##5.1±1.7骨小梁寬度，μm 41.7±9.9 10.3±2.8＊＊25.2±7.7##28.7±16.8##14.9±4.8#12.8±8.2

與空白對照組比較，模型組小鼠股骨濕質量、干質量降低（P＜0.05或P＜0.01），股骨直徑減少（P＜0.05），股骨長度無顯著變化（P＞0.05）；與模型組比較，陽性對照組和DZ-M組小鼠股骨濕質量增加（P＜0.05），DZ-M組小鼠股骨干質量和股骨直徑增加（P＜0.05）。結果見

表4 。表4 各組小鼠股骨計量學指標測定結果（±s，n＝12）Tab 4 The metrology index of femur in mice in each group（±s，n＝12）

表4 。表4 各組小鼠股骨計量學指標測定結果（±s，n＝12）Tab 4 The metrology index of femur in mice in each group（±s，n＝12）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05

組別空白對照組模型組陽性對照組DZ-H組DZ-M組DZ-L組股骨直徑，mm 1.77±0.09 1.66±0.13＊1.74±0.13 1.72±0.09 1.74±0.09#1.66±0.13劑量，g/kg 0.50 1.90 0.95 0.48股骨濕質量，mg 56.0±5.9 48.5±6.4＊＊54.0±8.0#50.5±5.5 54.2±7.7#49.8±5.5股骨干質量，mg 36.2±6.5 30.8±4.6＊33.5±6.0 33.2±6.6 35.1±6.1#32.3±5.4股骨長度，mm 13.3±0.5 13.1±0.4 13.3±0.6 13.3±0.8 13.2±0.5 13.4±0.6

4 討論

骨質疏松是一種骨代謝性疾病，表現為骨密度降低，骨礦元素含量減少，骨小梁變細、數目變少，骨脆性增加，骨折危險性加大等。現代醫學認為，骨質疏松是機體在生理老化基礎上由遺傳及環境等多種因素共同作用的結果，骨質疏松產生的主要原因是雌激素缺乏和鈣攝入量不足，以致骨吸收大于骨形成[7]。中醫學認為，骨質疏松屬于中醫“骨痿”“骨痹”范疇，其發生首先當責之于腎虛精虧，多采用補腎填精壯骨之法治療[8-9]。在進行維甲酸致骨質疏松動物研究時，多選擇鈣劑、維生素D等作為陽性對照藥物，但也有研究者選擇中成藥（如仙靈骨葆膠囊）[10]，且仙靈骨葆膠囊已成為臨床上治療骨質疏松的重要中成藥。

小鼠按105 mg/kg劑量連續給予維甲酸14 d后，與空白對照組比較，模型組小鼠體質量、胸腺指數顯著降低，這提示維甲酸對小鼠有一定的免疫抑制作用；股骨干、濕質量均顯著減輕，股骨直徑顯著減少，這提示維甲酸對于小鼠骨生長具有明顯抑制作用；血清鈣、血清磷含量升高，這提示維甲酸可誘導骨代謝活躍、骨轉換率升高；股骨病理檢測發現模型組小鼠股骨骨小梁稀疏、變細、斷裂、排列紊亂，骨小梁面積百分比、寬度、數目均減少，這進一步表明其可抑制骨形成，最終導致骨質疏松。給予DZ后，小鼠體質量雖未見明顯恢復，但重要臟器指數卻得到不同程度改善，股骨干、濕質量及股骨直徑均增加，血清鈣、磷含量顯著降低，骨小梁面積百分比、寬度、數目均增加，這提示DZ能夠有效地增強免疫，促進骨生長趨于正常，抑制血鈣、血磷流失，促進骨鈣、骨磷吸收，對于骨質疏松具有明顯的改善作用。

本研究結果發現DZ-H組小鼠的指標變化不如中、低劑量組，其原因可能是高劑量組給藥劑量較大，藥物吸收不完全，或者是因劑量較大，藥物成分間相互影響所致。在實驗中，因每組均有個別血清樣本出現溶血或血量過少的情況，故每組均隨機選擇10個血液樣本進行血清鈣、磷的測定；病理檢測則每組隨機選擇8個樣本進行檢測。

綜上所述，DZ ig給藥后對維甲酸致小鼠實驗性骨質疏松有明顯的改善作用，但其具體作用機制還有待進一步研究。

參考文獻

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Improvement Effect of Duzhong Zhuanggu Pills on Retinoic Acid-induced Osteoporosis in Mice

LIU Ming1，XUAN Zhenhua2，ZHANG Yongping2，LIU Yi2，LIU Li3，WANG Haiyang3（1.School of Basic Medicine，Guiyang University of Chinese Medicine，Guiyang 550025，China；2.School of Pharmacy，Guiyang University of Chinese Medicine，Guiyang 550025，China；3.Guiyang Dechangxiang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guiyang 550002，China）

OBJECTIVE：To investigate improvement effect of Duzhong zhuanggu（DZ）pills on retinoic acid-induced osteoporosis in mice.METHODS：72 KM mice were randomized into blank control group（normal saline），model group（normal saline），positive control group（Xianling gubao capsule，0.50 g/kg），DZ pills high-dose，medium-dose and low-dose groups（1.90，0.95，0.48 g/kg，DZ-H，DZ-M，DZ-L groups），with 12 mice in each group.Except for blank control group，other groups were given retinoic acid intragastrically to induce osteoporosis model，and given relevant medicine intragastrically once a day，for 14 days.After last administration，body weight of mice was determined；the blood sample was collected from eyeball to determine the contents of serum calcium and phosphor；liver，spleen and thymus gland were collected to determine organ index；left femur was collected to determine bone wet weight，bone dry weight，length and diameter；right femur was collected to determine the area percentage，width and number of bone trabecula.RESULTS：Compared with blank control group，the body weight of mice in model group were decreased；the contents of serum calcium and phosphorus were increased；liver indexes and spleen indexes were increased，while thymus indexes were decreased；bone wet weight，bone dry weight，length and diameter were decreased；area percentage，width and number of trabecular were decreased，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group，the contents of serum calcium were decreased in treatment groups，and the contents of serum phosphorus were decreased in positive control group，DZ-M and DZ-L groups.Thymus indexes were increased in positive control group，DZ-M and DZ-L groups，while liver indexes were decreased in positive control group；femur wet weight of positive control group as well as femur dry and wet weight，diameters of DZ-M were all increased.The percentage，width and number of bone trabecula were increased in positive control group，DZ-H and DZ-M group，and the number of bone trabecula was increased in DZ-L group，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：DZ pills have improvement effect on osteoporosis induced by retinoic acid in mice.

Duzhong zhuanggu pills；Retinoic acid；Osteoporosis model；Mice；Metrology index of femur

R285.5

A

1001-0408（2017）01-0035-04DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.09

2016-07-04

2016-10-16）

（編輯：林 靜）

貴州省科技計劃子課題（No.黔科合重大專項字〔2012〕6009號）

＊副教授，博士。研究方向：中藥、民族藥防治心腦血管疾病藥理。電話：0851-88308013。E-mail：393617518@qq.com

#通信作者：教授。研究方向：中藥新制劑。E-mail：642055255 @qq.com