微乳液相色譜法同時測定大鼠灌服大花羅布麻葉提取物后血漿中4種黃酮類成分的含量Δ

莊魯江，劉金巖，李歡歡，周 軍（.新疆維吾爾自治區人民醫院藥學部，烏魯木齊 83000；2.新疆醫科大學基礎部藥理教研室，烏魯木齊 8300；3.新疆農業大學醫院藥房，烏魯木齊 830052；4.新疆軍區烏魯木齊總醫院藥劑科，烏魯木齊 830002）

微乳液相色譜法同時測定大鼠灌服大花羅布麻葉提取物后血漿中4種黃酮類成分的含量Δ

莊魯江1＊，劉金巖1，李歡歡2，3，周 軍4#（1.新疆維吾爾自治區人民醫院藥學部，烏魯木齊 830001；2.新疆醫科大學基礎部藥理教研室，烏魯木齊 830011；3.新疆農業大學醫院藥房，烏魯木齊 830052；4.新疆軍區烏魯木齊總醫院藥劑科，烏魯木齊 830002）

目的：建立同時測定大鼠血漿中槲皮素-3-O-槐糖苷、羅布麻甲素、金絲桃苷、蕓香苷4種黃酮類成分含量的方法。方法：取8只SD大鼠，ig大花羅布麻葉提取物混懸液，0.1 g/kg（以提取物計）。給藥后1 h于眼眶采血1 mL，離心后采用微乳液相色譜法（MELC）測定4種黃酮類成分含量。色譜柱為Zorbax SB-C18，流動相為微乳體系[月桂醇聚氧乙烯醚-正丁醇-乙酸乙酯-三乙胺-水（體積比為2.5∶3.0∶1.7∶0.3∶92.5，pH＝5.0）]，流速為0.8 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為360 nm，進樣量為10 μL，內標為巖白菜素。同時與使用常規有機溶劑為流動相的高效液相色譜法（HPLC，流動相為0.2%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脫，其余條件同MELC法）進行相關比較。結果：大鼠血漿中槲皮素-3-O-槐糖苷、羅布麻甲素、金絲桃苷、蕓香苷檢測質量濃度線性范圍為10～1 000 ng/mL（r≥0.998 0），定量下限（信噪比為10）均為10 ng/mL，精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均不超過7.5%（n＝5），平均加樣回收率在97.4%～98.5%之間（RSD均不大于5.3%，n＝5），提取回收率均在88.7%～100.3%之間（RSD均不大于6.14%，n＝5）。MELC與HPLC的方法學考察結果均符合藥典規定，血藥濃度測定結果相近，但與HPLC法比較，MELC法可縮短檢測時間（10 min vs.40 min），減少有機溶劑使用量（0.38 mL vs.28 mL）。結論：本研究建立的MELC法快速簡便、綠色環保，可用于大鼠血漿中大花羅布麻葉4種黃酮類成分的同時測定。

微乳液相色譜法；大鼠；血漿；大花羅布麻葉；黃酮類成分；含量測定

大花羅布麻Poacynum hedersonni（Hook.F.）Woodson是夾竹桃科白麻屬植物，其藥用部位是葉[1]。研究表明大花羅布麻葉具有降血壓、降血脂、強心、抗血栓、抗氧化和腦保護等作用[2-3]。現代藥理學研究證明，槲皮素-3-O-槐糖苷、羅布麻甲素、金絲桃苷和蕓香苷等4種黃酮類成分為大花羅布麻葉的主要有效成分[4]。隨著大花羅布麻葉在臨床應用上的深入[5]，有必要建立一種簡單有效的方法以測定生物樣品中4種黃酮成分含量。

微乳液相色譜法（Microemulsion liquid chromatography，MELC）是以微乳為流動相的高效液相色譜法（HPLC）[6]，具有綠色環保、分離效率高、速度快、復雜樣品無需預處理等優勢[7-8]。在本研究中，筆者采用MELC法對大鼠灌服大花羅布麻葉提取物后血漿中4種黃酮類成分進行測定，為大花羅布麻葉的進一步研究提供理論基礎。

1 材料

1.1 儀器

1100 HPLC儀，包括G1354A四元梯度泵、G1315A二極管陣列紫外檢測器（DAD）、G1313A自動進樣器、G1316A可調柱溫恒溫箱和Agilent色譜工作站（美國Agilent公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

大花羅布麻葉（新疆本草堂中藥飲片有限公司，批號：201500606），經新疆中藥民族藥研究所劉發主任藥師鑒定為真品；槲皮素-3-O-槐糖苷對照品（批號：18609-17-1）、羅布麻甲素對照品（批號：21637-25-2）、金絲桃苷對照品（批號：482-36-0）、蕓香苷對照品（批號：153-18-4）均購自美國Sigma-Aldrich公司，純度均不低于95%；巖白菜素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111532-201402，純度：98%）；十二烷基硫酸鈉、月桂醇聚氧乙烯醚、十二烷基聚乙二醇醚、聚氧乙烯單叔辛基苯基醚、正辛烷、正己烷、環己烷、乙酸乙酯、三乙胺、磷酸等均為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

1.3 動物

健康SD大鼠8只，♂，體質量（220±20）g，蘭州軍區烏魯木齊總醫院實驗動物中心[動物合格證號：SYXK（軍）2007-023]。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素-3-O-槐糖苷、羅布麻甲素、金絲桃苷和蕓香苷對照品各5 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解，定容，即得質量濃度均為200 μg/mL的對照品溶液。

2.1.2 內標溶液的制備 精密稱取巖白菜素對照品5 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解，定容，即得質量濃度為200 μg/mL的內標貯備液。使用時，稀釋成質量濃度為50 ng/mL的內標溶液。

2.2 微乳流動相的制備

將2.5%（體積分數，下同）月桂醇聚氧乙烯醚（表面活性劑）、3.0%正丁醇（助表面活性劑）、1.7%乙酸乙酯（油相）、0.3%三乙胺（添加劑）、92.5%水溶液混合，磷酸（H3PO4）調節pH至5.0，超聲（功率：200 W，下同）20 min，經0.45 μm濾膜過濾后，超聲20 min，即得透明穩定的微乳流動相溶液，靜置過夜，備用。

2.3 大花羅布麻葉提取物的制備

精密稱取大花羅布麻葉藥材100 g，用75%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并濾過液，經減壓蒸餾和凍干后，共獲得9.03 g固體提取物。精密稱取固體提取物適量，用微乳流動相稀釋至質量濃度為250 ng/mL，經0.45 μm濾膜過濾后，按“2.6.1”項下色譜條件進樣測定。結果，大花羅布麻葉固體提取物中含槲皮素-3-O-槐糖苷、羅布麻甲素、金絲桃苷、蕓香苷分別為12.64、9.39、4.23、6.65 μg/g。2.4 給藥與取血

取SD大鼠8只，禁食不禁水12 h后，取“2.3”項下大花羅布麻葉提取物，加入0.5%羧羥基纖維素鈉水溶液制成混懸液后ig給藥，0.1 g/kg（以提取物計，給藥劑量依據前期藥動學及安全性考察結果確定）。給藥1 h后從大鼠眼球取血1 mL，置于經肝素抗凝的EP管中，以離心半徑為11 cm、4 000 r/min離心5 min，分離血漿，于－20℃冰箱冷凍保存，備用。

2.5 血漿樣品的處理

取空白血漿、“2.4”項下凍存血漿（置于37℃水浴中融化），各吸取200 μL置于2.0 mL EP管內，加內標溶液40 μL、微乳流動相1.0 mL，于旋渦混合器混勻5 min后，以離心半徑為9 cm、13 000 r/min離心5 min，取上清液進樣測定。

2.6 色譜條件與方法學考察

2.6.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：月桂醇聚氧乙烯醚-正丁醇-乙酸乙酯-三乙胺-水（體積比為2.5∶3.0∶1.7∶0.3∶92.5，pH＝5.0）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；內標：巖白菜素。

2.6.2 專屬性 取大鼠空白血漿、空白血漿+對照品溶液+內標溶液、給藥后大鼠血漿+內標溶液各200 μL，按“2.5”項下方法處理后，再按“2.6.1”項下色譜條件進樣測定。結果顯示，在該色譜條件下，理論板數以4種黃酮類成分計均不低于8 000，分離度均大于1.5，血漿中的內源性物質不干擾黃酮類成分與內標物的測定。色譜圖見圖1。

圖1 微乳液相色譜圖Fig 1 MELC chromatogrms

2.6.3 線性關系與定量下限 取“2.1.1”項下對照品溶液適量，依次加入200 μL空白血漿，制成質量濃度為10、50、100、500、1 000 ng/mL的系列血漿溶液，按“2.5”項下方法處理。精密吸取上述系列對照品血漿溶液各10 μL，按“2.6.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以槲皮素-3-O-槐糖苷、羅布麻甲素、金絲桃苷、蕓香苷的質量濃度（x，ng/mL）為橫坐標，以色譜峰面積比（y）為縱坐標進行線性回歸。結果，4種黃酮類化合物的線性方程依次為y＝0.054 1x+0.022 7（r＝0.998 8）、y＝0.047 5x+0.020 1（r＝0.998 5）、y＝0.019 3x+0.022 4（r＝0.998 5）、y＝0.028 5x+0.023 5（r＝0.998 0），線性范圍均為10～1 000 ng/mL；定量下限（信噪比為10）均為10 ng/mL，檢測限（信噪比為3）依次為2.9、3.1、3.3、3.2 ng/mL。

2.6.4 精密度 精密吸取“2.6.3”項下低、中、高（10、100、1 000 ng/mL）3種質量濃度的血漿溶液各200 μL，共5份，按“2.5”項下方法處理后，再按“2.6.1”項下色譜條件進樣測定。分別于當日和連續5 d內進樣測定，記錄峰面積。結果，4種黃酮類成分日內、日間精密度RSD均小于7.5%（n＝5），表明本方法精密度良好。

2.6.5 穩定性 取“2.6.4”項下的3種質量濃度血漿溶液各5份，分別于放置0、2、5、10、15 d時，按“2.5”項下方法處理，再按“2.6.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，4種黃酮類成分峰面積的RSD均小于7.2%（n＝5），表明4種黃酮類成分在15 d內穩定性良好。

2.6.6 重復性 取“2.6.4”項下3種質量濃度血漿溶液各5份，按“2.5”項下方法處理后，按“2.6.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，4種黃酮類成分的RSD均小于4.5%（n＝5），表明本方法重復性較好。

2.6.7 加樣回收率 取“2.6.4”項下3種質量濃度血漿溶液各200 μL，精密加入已知質量濃度（200 ng/mL）的血漿樣品溶液100 μL，按“2.5”項下方法處理后，再按“2.6.1”項下色譜條件連續測定5次。結果，4種黃酮類成分的平均加樣回收率在97.4%～98.5%之間（RSD≤5.3%，n＝5）。

2.6.8 提取回收率 取“2.6.4”項下3種質量濃度血漿溶液適量，各5份，按“2.5”項下方法處理后，再按“2.6.1”項下色譜條件進樣測定。結果，4種黃酮類成分的提取回收率分別為（94.5±5.8）%、（95.5±4.7）%、（94.9± 5.2）%、（96.1±3.8）%，RSD分別為6.14%、4.92%、5.48%、3.95%（n＝5）。提取回收率在88.7%～100.3%之間（RSD均不大于6.14%），表明樣品提取回收率穩定，符合生物樣品分析要求。

2.7 樣品測定

取“2.4”項下大鼠血漿，按“2.5”項下方法處理后，再按“2.6.1”項下色譜條件進樣測定。結果，大鼠血漿中槲皮素-3-O-槐糖苷、金絲桃苷、羅布麻甲素和蕓香苷的血藥濃度分別為657.25、512.56、153.32、329.67 ng/mL，RSD分別為3.74%、3.87%、4.02%、4.08%（n＝8）。

2.8 MELC法與使用常規有機溶劑為流動相的HPLC法比較

通過參考文獻[9]、進行預實驗建立了使用常規有機溶劑為流動相的HPLC法（簡稱HPLC法），測定了大鼠血漿中4中黃酮類成分的含量。血漿處理過程如下：取血漿200 μL于離心管內，加“2.1.2”項下內標溶液（50 ng/mL）40 μL，混勻后加入乙腈1 mL，振蕩3 min，以離心半徑為9 cm、13 000 r/min離心3 min，取上清液0.8 mL，在45℃水浴中用氮氣吹干，加入200 μL甲醇溶解殘渣，作為血漿樣品溶液。色譜條件將流動相改為0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，30%B；5～15 min，30%B→40%B；15～30 min，40%B→60%B；30～40 min，60%B→70%B），其余條件同“2.6.1”項下。按照藥典規定對HPLC法的方法學進行考察，結果大鼠血漿中槲皮素-3-O-槐糖苷、羅布麻甲素、金絲桃苷、蕓香苷在質量濃度為10～1 000 ng/mL內線性關系良好（r≥0.998 2），定量下限（信噪比為10）均為10 ng/mL，精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均不超過6.9%（n＝5），平均加樣回收率在96.7%～97.9%之間（RSD均不大于6.1%，n＝5），提取回收率在95.2%～97.1%之間（RSD均不大于6.55，n＝5）。4類成分的血藥濃度分別為632.47、486.18、129.97、301.21 mg/mL，RSD分別為4.54%、4.71%、5.18%、5.42%（n＝8）。這表明兩種方法的方法學考察結果均符合藥典規定，但采用HPLC法分析，完成一次樣品分析的時間為40 min，乙腈的消耗量約28 mL。而本研究建立的MELC法在10 min內即可完成樣品分析，分離效率高（完全分離），且不消耗乙腈，乙酸乙酯用量約為0.14 mL，正丁醇約為0.24 mL。兩種液相色譜法圖見圖2（大鼠血漿+樣品+內標）。由此可見，采用MELC方法可大幅縮短檢測時間，大量減少有機溶劑的消耗，降低成本，綠色環保。

3 討論

3.1 微乳流動相的確定

3.1.1 表面活性劑的考察 筆者考察了十二烷基硫酸鈉、十二烷基聚乙二醇醚、月桂醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯單叔辛基苯基醚等表面活性劑對4種黃酮類成分的分離效果。結果，非離子型表面活性劑月桂醇聚氧乙烯醚在210 nm波長處無吸收、色譜基線穩定，故選擇月桂醇聚氧乙烯醚作為最佳表面活性劑。同時，考察月桂醇聚氧乙烯醚的體積分數對4種黃酮類成分的分離選擇性的影響。結果顯示，月桂醇聚氧乙烯醚體積分數為2.5%時，4種黃酮類成分的分離效果最好。

3.1.2 助表面活性劑的考察 分別選擇正丁醇、正戊醇、正丙醇、異丙醇為助表面活性劑，考察其對4種黃酮類成分色譜行為的影響。結果顯示，3.0%正丁醇對4種黃酮類類成分的保留時間最適合，分離效果最優。

3.1.3 油相的考察 筆者考察了正辛烷、正己烷、環己烷、正庚烷、甲苯、乙酸乙酯作為油相對分離效果的影響。結果表明，1.7%乙酸乙酯對4種黃酮類成分的洗脫能力最強、分離效果最理想。

3.1.4 添加劑和pH值的考察 因為黃酮類成分多帶有羥基，因此三乙胺濃度和pH值對黃酮類成分的保留時間有較大影響。當三乙胺濃度為0.3%時，4種黃酮類成分的保留時間均縮短；當pH＝5.0（用適量H3PO4調節）時，4種黃酮類成分分離度最好。

3.1.5 溫度的考察 柱溫對微乳液相色譜的分離也有一定影響。本研究表明，當柱溫≥30℃時，4種黃酮類成分的峰形較好，柱效明顯提高。考慮到樣品和色譜柱對溫度的耐受性，最終選擇柱溫為30℃。

3.2 MELC法的優點

生物樣品多需經過預處理才能進行儀器分析。主要的樣品預處理方法有液-液萃取法[10]、固相萃取法[11]等，但這些方法存在分離步驟多、有效成分易損失、有機溶劑使用量大、分析結果精密度和準確度不理想等不足[12]。本試驗采用MELC法同時測定大鼠血漿中4種黃酮類成分的含量，血漿樣品可以經稀釋后直接進樣，明顯減少了操作步驟，縮短了分析時間，降低了分析物的損失，減少了有機溶劑用量，且方法學考察結果顯示該方法具有準確、穩定、重復性好、靈敏度高等特點。

綜上所述，本文建立的MELC法可以滿足大鼠灌服大花羅布麻葉提取物后血漿中4種黃酮類成分定量測定的要求，對研究該藥物的體內過程和臨床日常監測具有參考意義。

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Simultaneous Determination of 4 Flavonoids from Poacynum hendersonii Leaf Extract in Rat Plasma Sample with Intragastric Administration by Microemulsion Liquid Chromatography

ZHUANG Lujiang1，LIU Jinyan1，LI Huanhuan2，3，ZHOU Jun4（1.Dept.of Pharmacy，Xinjiang Uygur Autonomous Region People’s Hospital，Urumqi 830001，China；2.Pharmacology Teaching and Research Section，Basic Medical College，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；3.Dept.of Pharmacy，Xinjiang Agricultural University Hospital，Urumqi 830052，China；4.Dept.of Pharmacy，Urumqi General Hospital of Xinjiang Military Command，Urumqi 830002，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the simultaneous determination of 4 flavonoids in rat plasma sample，such as quercetin-3-O-sophoroside，isoquercitrin，hyperin，rutin.METHODS：8 SD rats were selected and given Poacynum hendersonii leaf extract suspension intragastrically 0.1 g/kg（calculated by extract）.The blood sample 1 mL was collected from orbit 1 h after medication.The contents of 4 flavonoids were determined by microemulsion liquid chromatography（MELC）after centrifugation.The separation was performed on Zorbax SB-C18column with mobile phase consisted of microemulsion[polyoxyethylene lauryl ether-n-butanol-ethyl acetate-triethylamine-water（volume ratio was 2.5∶3.0∶1.7∶0.3∶92.5，pH＝5.0）]at the flow rate of 0.8 mL/min.The column temperature was set at 30℃，and detection wavelength was 360 nm.Sample size was 10 μL，and internal standard was bergenin.It was compared with HPLC method using organic solvent as mobile phase（mobile phase consisted of 0.2% phosphoric acid solution-acetonitrile，gradient elution，other condition same as MELC method）.RESULTS：In rats plasma，the linear range of quercetin-3-O-sophoroside，isoquercitrin，hyperin，rutin were 10-1 000 ng/mL（r≥0.998 0）.The limits of quantitation was 10 ng/mL（S/N＝10）.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all below 7.5%（n＝5）.Average sample recoveries were between 97.4%-98.5%and RSDs were less than 5.3%（n＝5）.Extraction recoveries were between 88.7%-100.3%（RSD≤6.14%，n＝5）.The methodological evaluation results of MELC and HPLC method were all in line with the regulations of pharmacopeia，and the results of blood concentration between them were similar.Compared with HPLC method，MELC method could shorten detection time（10 min vs.40 min）and reduce the amount of organic solvent（0.38 mL vs.28 mL）. CONCLUSIONS：Established MELC method is rapid，simple and green，and can be used for 4 flavonoids from P.henderso-nii leaf in rat plasma sample.

Microemulsion liquid chromatography；Rat；Plasma；Poacynum hendersonii leaf；Flavonoids；Content determination

R917

A

1001-0408（2017）01-0039-04

2016-06-01

2016-11-11）

（編輯：劉明偉）

新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目（No.2015211C246）

＊副主任藥師。研究方向：中藥藥理學。電話：0991-8564433。E-mail：732407306@qq.com

#通信作者：副主任藥師，博士。研究方向：中藥藥理學。電話：0991-4992865。E-mail：sjbzj415@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.10