人單核細胞THP-1源性泡沫細胞內雷帕霉素含量測定的HPLC法的建立及應用Δ

胡華鐘，王仲萍，陳亦清，朱秋連，林彩燕，嚴鵬科#（.廣州醫科大學附屬第三醫院藥學部，廣州 5050；.廣州同鵬中旭醫藥科技有限公司，廣州 5050）

人單核細胞THP-1源性泡沫細胞內雷帕霉素含量測定的HPLC法的建立及應用Δ

胡華鐘1＊，王仲萍2，陳亦清2，朱秋連1，林彩燕1，嚴鵬科1#（1.廣州醫科大學附屬第三醫院藥學部，廣州 510510；2.廣州同鵬中旭醫藥科技有限公司，廣州 510510）

目的：建立人單核細胞THP-1源性泡沫細胞內雷帕霉素（RAPA）含量的測定方法，研究RAPA靶向制劑（RAPA-NP-Apt）對泡沫細胞的靶向作用。方法：以氧化型低密度脂蛋白誘導THP-1細胞建立泡沫細胞模型，取200 ng/mL的RAPA和200、400、800 ng/mL的RAPA-NP-Apt與泡沫細胞共同孵育60 min。采用高效液相色譜法（HPLC）測定細胞內RAPA含量，色譜柱為Diamonsil C18，流動相為乙腈-水（90∶10，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為278 nm，進樣量為20 μL。結果：RAPA檢測質量濃度線性范圍為50～6 400 ng/mL（r＝0.999 96），平均回收率為98.72%（RSD＝0.62%，n＝3），日內、日間RSD均不大于6.15%（n＝6），穩定性試驗的RSD＜2%（n＝6），重復性試驗的RSD＝1.64%（n＝6）。RAPA和低、中、高質量濃度的RAPA-NP-Apt與泡沫細胞共孵育后RAPA的含量分別為12、43、98、140 ng/106個細胞。結論：本方法操作簡單，穩定性和重復性好，可用于泡沫細胞內RAPA的含量測定。RAPA-NP-Apt可提高RAPA對泡沫細胞的靶向作用。

高效液相色譜法；雷帕霉素；含量測定；靶向藥物；泡沫細胞

雷帕霉素（RAPA）是一種疏水性大環內酯類免疫抑制劑，能特異性抑制冠脈支架置入后血管平滑肌細胞的過度增殖，降低冠脈支架置入后再狹窄的發生率[1]。但該藥物全身給藥對再狹窄療效不佳，故一直采用藥物涂層于支架的方法，局部用藥治療動脈粥樣硬化（Athero-sclerosis，AS）病變。由于給藥方式、劑量、給藥時間受限等因素，易造成晚期支架內血栓形成和支架內再狹窄等臨床安全性問題[2-4]。

泡沫細胞的形成是AS早期的標志，在AS的發生發展中具有重要的作用。本課題組已將前期研究獲得的特異性靶向泡沫細胞的適配子與雷帕霉素納米粒構建成靶向納米給藥體系，旨在替代現有的抗再狹窄藥物涂層于支架的靶向模式，防治支架內再狹窄。本研究采用高效液相色譜法建立了細胞內RAPA含量的測定方法，分析RAPA靶向制劑對AS泡沫細胞的靶向作用，以期為研發具抗AS作用的RAPA靶向制劑提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀，包括G1322A在線脫氣機、G1313A自動進樣器、G4212B二極管陣列紫外檢測器（DAD）和色譜化學工作站（美國Agilent公司）；5804低溫離心機（德國Eppendorf公司，離心半徑：95 mm）；BP310P電子天平（德國Sartorius公司）；M3800-C超聲波清洗機（美國Bransonic公司）。

1.2 藥品與試劑

RAPA靶向制劑（RAPA-NP-Apt，批號：2015090606，載藥量：13%）、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL，批號：2015062301，規格：14 mg/L）均由廣州醫科大學附屬第三醫院藥劑科實驗室自制；RAPA對照品（廣州慈銘生物公司，批號：140503，純度：99.4%）；油紅O（美國Sigma公司）；乙腈為色譜純，丙酮、乙醇為分析純。

1.3 細胞株

人單核細胞THP-1購自中國科學院上海細胞所。

2 方法與結果

2.1 泡沫細胞模型的建立及鑒定

THP-1細胞培養于6孔培養板中，置于5%CO2、37℃的培養箱中培養。試驗前用100 nmol/L的丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）誘導72 h，使其分化成巨噬細胞，再用80 mg/L的ox-LDL孵育72 h，誘導成泡沫細胞[5]。取泡沫細胞用油紅O[油紅O-去離子水（3∶2）]染色10 min，再用60%的異丙醇漂洗，顯微鏡下觀察細胞形態和脂滴的變化。結果顯示，細胞胞漿體積增大且細胞內含大量紅色脂滴，與泡沫細胞的形態特點相符，表明泡沫細胞誘導成功。THP-1細胞及其泡沫細胞的鑒定結果見圖1。

圖1 THP-1細胞及其泡沫細胞的鑒定圖（油紅O染色，×400）Fig 1 Identification of THP-1 cells and foam cells（Oil red O staining，×400）

2.2 溶液的制備

2.2.1 RAPA對照品溶液 精密稱取RAPA對照品0.1 g，置于100 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，制成1 mg/mL的RAPA對照品溶液。

2.2.2 細胞內液 泡沫細胞用冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，去上清，加入200 μL的乙腈，超聲振蕩20 min

破壁，再收集，渦旋振蕩20 min，13 000 r/min（離心半徑：95 mm）離心10 min，收集上清液，即得。

2.2.3 RAPA標準細胞液 取細胞內液875 μL，加125 μL的RAPA對照品溶液，混勻即得。

2.2.4 細胞樣品溶液 取泡沫細胞（106mL－1），分別加入含RAPA[溶于0.1%二甲基亞砜（DMSO）]或RAPANP-Apt的培養基，孵育60 min后，細胞用冷的PBS清洗3次，去上清。加入200 μL的乙腈，超聲20 min破壁，再收集，渦旋振蕩20 min，13 000 r/min（離心半徑：95 mm）離心10 min，收集上清液，即得。

2.3 含量測定方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（90∶10，V/V），流速：1 mL/min；檢測波長：278 nm；柱溫：40℃；進樣量：20 μL。

2.3.2 專屬性試驗 取細胞內液、RAPA標準細胞液、RAPA細胞樣品溶液，分別按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析。結果顯示，細胞內液中RAPA的出峰時間約為5.811 min，內源性物質不干擾其測定。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.3.3 線性關系考察 按“2.2.3”項下方法制備質量濃度分別為50、100、200、400、800、1 600、3 200、6 400 ng/mL的RAPA標準細胞液，照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定。以雷帕霉素質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，進行回歸分析，得回歸方程為y＝510.369 19x+ 2.381 436 5（r＝0.999 96）。結果表明，RAPA檢測質量濃度的線性范圍為50～6 400 ng/mL，定量限為1 ng。

2.3.4 精密度試驗 按“2.2.3”項下方法制備質量濃度分別為200、800、1 600 ng/mL的RAPA標準細胞液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定。同日內檢測6次考察日內精密度，連續測定6 d考察日間精密度。結果，日內RSD分別為4.02%、4.38%、3.50%（n＝6），日間RSD分別為4.45%、5.51%、6.15%（n＝6），均不大于6.15%，表明精密度良好。

2.3.5 回收率試驗 按“2.2.3”項下方法制備質量濃度分別為200、800、1 600 ng/mL的RAPA標準細胞液，分別加入RAPA對照品16.24 ng，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結果顯示，平均回收率為98.72%，RSD＝0.62%（n＝3），表明準確性良好，結果見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

2.3.6 穩定性試驗 制備質量濃度為800 ng/mL的RAPA標準細胞液，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h時按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，考察穩定性。結果顯示，峰面積的RSD＝2.84%（n＝8），表明RAPA標準細胞液在48 h內穩定性良好。

2.3.7 重復性試驗 制備質量濃度為800 ng/mL的RAPA標準細胞液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，重復測定6次，考察重復性。結果顯示，峰面積的RSD＝1.64%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.3.8 樣品含量的測定 取含200 ng/mL RAPA的培養基和含200、400、800 ng/mL（低、中、高質量濃度）RAPA-NP-Apt的培養基，按“2.2.4”項下方法孵育細胞，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定細胞內RAPA的含量。采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，多組樣本均數間的比較采用單因素方差分析，兩組樣本均數間的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。結果顯示，RAPA和低、中、高質量濃度的RAPA-NP-Apt與泡沫細胞共孵育后RAPA的含量分別為12、43、98、140 ng/106個細胞。與RAPA比較，3個質量濃度的RAPA-NP-Apt在泡沫細胞中的含量均增加，差異有統計學意義（P＜0.05），結果見圖3。

圖3 樣品含量的測定結果Fig 3 Results of content determination of samples

3 討論

Guo J等[6]用熒光分析法來檢測適配子介導的靶向制劑對腦瘤細胞的靶向性，證明了靶向制劑對腦瘤細胞的靶向性良好。但熒光分析只能定性分析，不能定量分析，誤差比較大。本文采用高效液相色譜法檢測細胞內RAPA含量，分辨率和靈敏度更高，分析速度快，重復性更好，定量更精確。

高效液相色譜法的樣品提取一般采用液-液萃取法[7]，但液-液萃取法只能萃取到樣品中純的藥物，不能萃取到具有水溶性的納米粒里面的藥物。而本文的樣品是由納米粒包載的藥物，所以采用液-液萃取法提取的藥物的濃度檢測不準確。經過筆者的改進，采用超聲破碎后再用液-液萃取法，既可以破碎細胞，又可以破壞納米粒的結構，讓包載在納米粒中的RAPA溶出，使其可以直接定量分析，提高了試驗的準確度。

本文研究結果表明，RAPA-NP-Apt比RAPA有更好的生物相容性。低、中、高質量濃度的RAPA-NP-Apt在泡沫細胞中含量較RAPA高，且差異具有統計學意義（P＜0.05），進一步說明了RAPA-NP-Apt可提高RAPA對泡沫細胞的靶向作用。

本文建立了測定泡沫細胞內RAPA含量的方法，可用于分析RAPA靶向制劑對泡沫細胞的靶向作用，為RAPA靶向制劑用于治療AS的研究奠定了基礎。

[1] 劉春霄，邢玉華.國產雷帕霉素藥物涂層支架置入術對缺血性心肌病患者近中期預后影響的臨床研究[J].現代診斷與治療，2015，26（13）：2893-2895.

[2] 李年秀.藥物洗脫支架臨床應用安全性的影響因素[J].

中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（25）：4729-4732.

[3] 彭峰林.藥物支架材料特征與置入后再內皮化及晚期血栓形成的評價[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（29）：5447-5450.

[4] 王浩，李泱，張文輝，等.紫杉醇與雷帕霉素復合藥物涂層支架預防冠脈再狹窄動物實驗研究[J].河北醫藥，2013，35（2）：173-175.

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[7] 白玉國，魏國義，魏娟娟，等.HPLC-MS聯用同時測定血漿中舒血寧注射液中銀杏內酯A、B的含量[J].中國藥房，2011，22（16）：1516-1518.

Establishment and Application of HPLC Method for Content Determination of Rapamycin in Human Monocyte THP-1 Derived Foam Cells

HU Huazhong1，WANG Zhongping2，CHEN Yiqing2，ZHU Qiulian1，LIN Caiyan1，YAN Pengke1（1.Dept.of Pharmacy，the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510510，China；2.Guangzhou Tongpeng Zhongxu Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Guangzhou 510510，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of rapamycin（RAPA）in human monocyte THP-1 derived foam cells，and to study the effects of RAPA targeting preparation（RAPA-NP-Apt）targeting at foam cells.METHODS：Foam cells model were established through THP-1 cells were induced by oxidized low density lipoprotein.Foam cells were incubated with 200 ng/mL RAPA or 200，400，800 ng/mL RAPA-NP-Apt for 60 min.The content of RAPA was determined by HPLC.The determination was performed on Diamonsil C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（90∶10，V/V）at flow rate of 1.0 mL/min.The column temperature was set at 40℃，and the detection wavelength was 278 nm.The sample size was 20 μL.RESULTS：The concentration of RAPA ranged 50-6 400 ng/mL（r＝0.999 96）with average recovery of 98.72%（RSD＝0.62%，n＝3）.RSDs of inter-day and intra-day were not more than 6.15%（n＝6），RSD of stability was lower than 2%（n＝6），and RSD of repeatability was 1.64%（n＝6）.After foam cells were incubated with RAPA or low-concentration，medium-concentration and high-concentration of RAPA-NP-Apt，the contents of RAPA were 12，43，98，140 ng/106cells.CONCLUSIONS：The method is simple，stable and reproducible.It can be used for content determination of RAPA in foam cells.RAPA-NP-Apt can improve the effects of RAPA targeting at foam cells.

HPLC；Rapamycin；Content determination；Targeting medicine；Foam cells

R927.2

A

1001-0408（2017）01-0043-03

2016-05-16

2016-07-17）

（編輯：鄒麗娟）

廣東省科技計劃項目（No.2013B021800192）；廣州市科技計劃項目（No.2013J4100040）

＊碩士研究生。研究方向：動脈粥樣硬化。電話：020-62784060。E-mail：2012386379@qq.com

#通信作者：主任藥師，教授，碩士生導師。研究方向：動脈粥樣硬化發病機制與藥物干預。E-mail：yanpk988@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.11