熒光光譜法和分子對接研究拉米夫定、依非韋倫、替諾福韋與牛血清白蛋白的相互作用及機制Δ

劉 榮（上海市公共衛生臨床中心藥劑科，上海 201508）

熒光光譜法和分子對接研究拉米夫定、依非韋倫、替諾福韋與牛血清白蛋白的相互作用及機制Δ

劉 榮＊（上海市公共衛生臨床中心藥劑科，上海 201508）

目的：研究拉米夫定、依非韋倫、替諾福韋與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用及其機制。方法：通過熒光光譜法研究不同溫度下不同濃度的拉米夫定、依非韋倫、替諾福韋與BSA的結合反應，分別測定其熒光強度，根據Stern-Volmer方程等公式計算動態猝滅常數（KSV）、表觀猝滅常數（Kq）、結合常數（KA）、結合位點（n）和熱力學焓變（ΔH）、自由能變（ΔG）、熵變（ΔS），并運用Sybyl 6.7 Flex X模塊建立這3種藥物與BSA的分子對接模型。結果：3種藥物與BSA相互作用的Kq均大于2.0×1010L/（mol·s），且隨溫度的升高而降低，n均接近于1，其熱力學函數ΔG＜0、ΔS＜0、ΔH＜0。分子對接模型顯示，3種藥物主要與BSA的Sudlow部位Ⅰ亞結構域發生結合。結論：3種藥物與BSA之間存在相互作用，熒光猝滅方式以靜態猝滅為主，結合反應為自發分子作用過程，結合作用力均以氫鍵和范德華力為主。熒光試驗和分子對接研究結果一致，兩者可相互補充。

拉米夫定；依非韋倫；替諾福韋；牛血清白蛋白；熒光光譜法；分子對接

血清白蛋白（SA）作為循環系統中最豐富的可溶性蛋白，在所有蛋白質中一直是研究最廣泛的一類[1]。SA能夠與許多內源性和外源性物質（如藥物、氨基酸、脂肪酸、膽紅素、膽汁酸、甲狀腺素等）結合，起到存儲和轉運的作用[2-5]。在藥動學（吸收、分配、代謝和排泄）中，由于在血漿中的大多數藥物都與人血清白蛋白（HSA）結合，所以HSA控制著藥物的分配過程，因而HSA在藥動學研究中具有重要意義。前人已經做過很多這方面的研究，如Chaudhuri S等[6]通過熒光光譜法和分子對接模型研究了血紅蛋白與抗氧化非瑟酮和3-羥基黃酮的相互作用；Sandhya B等[7]通過熒光光譜法、圓二色性（CD）和三維熒光研究了司他夫定與HSA的相互作用；Bocedi A等[8]通過熒光光譜研究抗人類免疫缺陷病毒（HIV）藥物與HSA的結合情況。

在臨床治療中，抗HIV藥物的反轉錄酶抑制劑能夠有效抑制耐藥病毒株，具有較好的抗病毒作用，目前臨床已形成了穩定且有效的聯合治療方案，即高效抗反轉錄病毒治療（Highly active antiretroviral therapy，HAART）。替諾福韋（Tenofovir，TFV）和拉米夫定（Lamivudine，3TC）屬于核苷類反轉錄酶抑制劑（Nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTIs），依非韋倫（Efavirenz，EFV）屬于非核苷類反轉錄酶抑制劑（Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs），三者聯用是重要的一線抗艾滋病治療的聯合用藥方案。但是目前在臨床使用中發現，在中國人群中有很大部分人群在服藥半年后出現耐藥情況。故很有必要研究這些藥物與HSA的結合情況，其對研究這些藥物在體內的運輸、分布、代謝是非常重要的。由于牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）簡單易得、穩定性高，與HAS高度相似，故在許多生物化學以及藥理學研究中，均將BSA作為HSA的替代品[9]。筆者采用熒光光譜法和分子對接研究了拉米夫定、依非韋倫、替諾福韋與BSA的相互作用及其機制。

1 材料

1.1 儀器

LS55型熒光分光光度計（美國PerkinElmer公司）；PHS-3C型pH計（上海理達儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

3TC對照品（英國葛蘭素史克公司，批號：K026520，純度：＞99%）；TFV對照品、EFV對照品（上海安譜科學儀器有限公司，批號：CDDM-A825000、CDDM-E425000，純度：均＞99%）；BSA（上海愛紫特生物科技有限公司，批號：150320，規格：每瓶30 g）；三羥甲基氨基甲烷（阿拉丁化學試劑有限公司）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 BSA貯備液 精密稱定BSA溶于Tris-HCl緩沖液（pH 7.4，下同）中制成BSA貯備液（1.0×10－4mol/L），于4℃避光保存。

2.1.2 工作液 精密稱定3TC、TFV、EFV對照品溶于Tris-HCl緩沖液中，制成最終濃度均為1.0×10－4mol/L的工作液。

2.2 光譜測定

在9個10 mL的量瓶內用微量取樣器分別注入1 000 μL BSA貯備液，再分別加入不同量的工作液，使藥物終濃度分別為0、1×10－7、5×10－7、1×10－6、2×10－6、5×10－6、1× 10－5、2.5×10－5、5×10－5mol/L，用Tris-HCl緩沖液定容，混勻，置于25℃的水浴中孵育2 h。于熒光分光光度計上檢測，激發波長為280 nm，掃描波長范圍為285～450 nm的發射光譜，觀察熒光強度大小的變化并記錄340 nm波長處熒光發射光譜強度。試驗過程中用電子循環水浴控制樣品溫度。另外用同樣的方法掃描在37℃下反應產物的發射光譜，觀察340 nm波長處熒光強度大小的變化。

2.3 分子對接

在SGI Fuel R14000工作站上通過計算機輔助設計平臺Sybyl 6.7 Flex X模塊完成計算工作。BSA的晶體結構來源于蛋白質數據庫（Protein databank，PDB）。3TC、TFV、EFV的初始分子結構均從其與相應目標蛋白的晶體復合物中提取。提取分子在進行分子結構修正的基礎上，加氫原子及Gasteriger-Huckel電荷后進行分子優化，完成對接的配體準備工作。根據文獻[8]報道的化合物類似物結合模式選擇相應的結合區域，從結合區域中選擇多見于與抗HIV類藥物結合的氨基酸殘基Trp214作為對接結合亞域的關鍵性殘基，并且以此為中心選擇10 ?的對接區域檢索。對每個化合物對接計算所獲得的構象，對評分排名前10位的對接構象結構進行疊合及相似性分析，選擇最有代表性及合理性的對接構象進行分析。

3 結果

3.1 光譜

25℃下反應后，BSA在3種藥物不同濃度下的熒光光譜圖見圖1。

圖1 BSA在3種藥物不同濃度下的熒光光譜圖Fig 1 Fluorescence spectroscopy of BSA under different concentrations of 3 kinds of drugs

由圖1顯示，保持BSA濃度不變，隨著3TC、TFV、EFV濃度的增加，BSA的熒光發射強度有規律地減少，這表明3TC、TFV、EFV可以猝滅BSA的內部熒光，也發生了能量的轉移，3TC、TFV、EFV與BSA之間存在相互作用。根據Stern-Volmer方程：

式中，F0、F分別為BSA溶液中加入熒光猝滅分子前后的熒光發射強度，Kq為表觀猝滅常數，[Q]為所加入的抗病毒藥物的總濃度，KSV為動態猝滅常數，τ0為BSA熒光壽命（約10－8s）。對BSA在340 nm波長處的熒光強度進行數據處理，利用公式（1）對所得數據進行線性擬合，即可求得25、37℃時，BSA與3TC、TFV和EFV相互作用的KSV、Kq和r，結果見表1。

表1 不同溫度下3種藥物與BSA的KSV、Kq和r測定結果Tab 1 KSV，Kqand r of 3 kinds of drugs with BSA under different temperatures

根據文獻[10]中有關動態猝滅的數據，蛋白質等生物大分子的最大雙分子猝滅常數是2.0×1010L/（mol·s），KSV隨著溫度的升高而增加。BSA與3TC、TFV、EFV相互作用的Kq均大于2.0×1010L/（mol·s），且隨著溫度的升高而降低，說明BSA與3TC、TFV、EFV分子間的能量轉移屬于非輻射轉移過程，靜態猝滅是BSA發生熒光猝滅的主要原因，這可能是由BSA在基態時與抗病毒藥物反應形成新的配合物引起。

對于靜態猝滅，猝滅劑與熒光分子之間的結合常數（KA）可由熒光強度與猝滅劑濃度的關系求出：

按式（2）即可計算出3TC、TFV、EFV與BSA相互作用的結合常數（KA）以及結合位點（n），結果見表2。

表2 不同溫度下3種藥物與BSA的KA與n測定結果Tab 2 KAand n of 3 kinds of drugs with BSA under different temperatures

由表2可知，BSA與3TC、TFV、EFV之間n隨溫度升高而降低，表明3TC、TFV、EFV與BSA之間有很強的結合力，形成了一個結合位點；r均大于0.9，表明3TC、TFV、EFV與BSA之間相互作用的結合模式符合式（2）。

3.2 熱力學函數

在溫度變化不大時，反應的焓變（ΔH）可以看作一個常數。通過公式可以求出反應的自由能變（ΔG），然后再分別求出ΔH和熵變（ΔS）：

式中k1和k2分別是25、37℃下所得線性方程的截距。SA結構很復雜，其與藥物之間往往同時存在幾種作用力。本研究用熒光光譜法測定了BSA與3TC、TFV、EFV相互作用體系在25、37℃下的K，結合公式（3）（4）計算3TC、TFV、EFV與BSA的熱力學函數，結果見表3。

由表3可知，3TC、TFV、EFV與BSA結合過程的ΔG＜0、ΔS＜0，表明其作用過程是一個熵和自由能均減小的自發分子作用過程；3TC、TFV、EFV與BSA結合過程的ΔH＜0、ΔS＜0，說明其作用力均是以氫鍵和范德華力為主。

表3 不同溫度下3種藥物與BSA的ΔH、ΔG、ΔS測定結果Tab 3 ΔH，ΔG and ΔS of 3 kinds of drugs with BSA under different temperatures

3.3 分子對接

3種藥物與BSA的分子對接模型圖見圖2。

圖23 種藥物與BSA的分子對接模型圖Fig 2 Molecular docking model of 3 kinds of drugs with BSA

由圖2顯示，3TC、TFV、EFV主要與BSA的SudlowⅠ亞結構域發生結合。TFV分子中的丙基側鏈與Trp213形成疏水相互作用；3TC的嘧啶酮結構可與Leu197和Trp213形成“三明治”樣的π-π類型相互作用；EFV與 Trp213發生類似的π-π堆積作用。

4 討論

在本研究中，抗病毒藥物與BSA的結合情況通過測定熒光光譜進行。靜態猝滅是由于藥物與BSA發生了配合反應，合成了不發熒光的基態或激發態的藥物-BSA復合物引起的。激發態下的藥物-BSA復合物一般不會快速解離而是直接返回到基態，因此復合物是熒光發生改變的主要原因，而溫度升高會影響到藥物-BSA復合物的合成或降低其穩定性，使KSV隨著溫度升高而減小。本研究結果顯示，3TC、TFV、EFV與BSA間的熒光猝滅主要以靜態猝滅為主。同時也發現3TC、TFV、EFV與BSA的n隨著溫度的升高而降低，這表明在3TC、TFV、EFV與BSA的結合過程中有以共價形式存在的相互作用，但在其中起主要作用的還是以非離子形式存在的相互作用。

藥物分子和蛋白質之間的作用力主要有疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等。不同藥物與蛋白質結合的作用力類型是不同的。從熱力學觀點看，在一定的溫度和壓力下，藥物與蛋白質的結合反應能否自發進行取決于體系的ΔG，ΔG＜0有利于反應的自發進行。Ross PD等[11]總結出判斷生物大分子與小分子結合力性質和生物大分子自身結合力性質的熱力學規律，即根據反應前后熱力學ΔH和ΔS的相對大小，來判斷藥物與蛋白質之間的主要作用力類型：ΔH＞0、ΔS＞0為疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0為氫鍵和范德華力；ΔH＜0、ΔS＞0為靜電引力。本研究結果顯示，3TC、TFV、EFV與BSA結合過程的ΔG＜0、ΔS＜0，表明其作用過程是一個熵和自由能均減小的自發分子作用過程；ΔH＜0、ΔS＜0，表明其作用力均是以氫鍵和范德華力為主。

雖然BSA共含有7個不同的結構域，能夠與相應的配體發生結合，但與抗HIV藥物結合的區域則相對比較保守。3TC、EFV主要與HSA的SudlowⅠ亞結構域發生結合[8]。由于TFV已知是NRTIs，并且在結構上與EFV非常接近，因此可以合理假設TFV也結合在HSA的相同位點上。本研究發現，3TC、TFV、EFV與BSA的結合模式與HSA類似；此外，考慮到BSA與抗HIV藥物的相互作用可改變BSA的Trp213構象，并且誘導產生固有的色氨酸熒光猝滅效應，因此選擇Trp213作為模擬藥物-蛋白相互作用的關鍵性氨基酸殘基。

根據TFV與BSA的分子對接結果，TFV分子中的丙基側鏈與Trp213形成疏水相互作用，且其結構上的6-位氨基與Leu480上的酰胺基團形成氫鍵。3TC的嘧啶酮結構可與Leu197和Trp213形成“三明治”樣的π-π類型相互作用；此外，3TC嘧啶酮上的氨基基團還與Ser201、Arg198形成了定向的氫鍵相互作用。此類相互作用都可能對3TC所表現出的相對較高的BSA親和力有貢獻。而EFV的苯環還可與Trp213發生類似的π-π堆積作用；此外，該苯環還可與Arg194上的堿性胍基產生一個額外的陽離子-π相互作用。這樣的疏水作用同樣也應對EFV的高BSA親和力有貢獻。本文所考察的3種抗HIV藥物都結合在BSA的相同結構亞域（均以Trp213為中心）之中，雖然各自的結合方式并不相同，但其對血漿蛋白結合行為及潛在的藥物-藥物相互作用產生了影響。若患者同時服用3種藥物，可導致藥物在血漿中競爭結合相同位點，故三者間存在相互作用。

熒光光譜法與分子對接是研究抗病毒藥物與BSA的相互作用的有效互補的2種研究方法。BSA與藥物結合的信息可使研究者更好地了解藥物在體內的吸收、分布情況以及藥物的毒性。

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Interaction between Bovine Serum Albumin with Lamivudine，Efavirenz，Tenofovir and Its Mechanism by Fluorescence Spectroscopy and Molecular Docking

LIU Rong（Dept.of Pharmacy，Shanghai Public Health Clinical Center，Shanghai 201508，China）

OBJECTIVE：To study the interaction between bovine serum albumin（BSA）with lamivudine，efavirenz，tenofovir and its mechanism.METHODS：Fluorescence spectroscopy was used to determine the interaction between BSA with different concentrations of lamivudine，efavirenz，tenofovir under different temperatures.The fluorescence intensity of them were determined respectively；quenching constant（KSV），apparent quenching constant（Kq），binding constant（KA），binding site（n），thermodynamic enthalpy change（ΔH），free energy diversification（ΔG）and entropy change（ΔS）were calculated according to Stern-Volmer equation and so on.Molecular docking model of 3 drugs with BSA was established by using Sybyl 6.7 Flex X model.RESULTS：Kqfor the interaction between 3 drugs with BSA were all higher than 2.0×1010L/（mol·s），and were decreased with the increase of temperature；all n were close to 1，and thermodynamic functions ΔG＜0，ΔS＜0，ΔH＜0.Molecular docking model showed that 3 drugs were mainly bound with BSA at SudlowⅠ subdomain site.CONCLUSIONS：There are the interaction between 3 drugs with BSA；fluorescence quenching mainly manifests as static quenching；binding reaction belongs to spontaneous molecular action process；binding force mainly includes hydrogen bond and Van der Waals’force.The result of fluorescence experiment is consistent with those of molecular docking，and they complement each other.

Lamivudine；Efavirenz；Tenofovir；Bovine serum albumin；Fluorescence spectroscopy；Molecular docking

O657.3；R978.7

A

1001-0408（2017）01-0049-05

2016-05-17

2016-07-15）

（編輯：鄒麗娟）

上海市公共衛生臨床中心科研課題計劃面上項目（No.2014M07）

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥物分析。電話：021-37990333-5313。E-mail：liurong@shaphc.org

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.13