阿立哌唑對Aβ25-35誘導的神經PC12細胞損傷的影響及機制

楊淑珍，趙晶媛（新鄉醫學院第二附屬醫院精神七科，河南新鄉 453002）

阿立哌唑對Aβ25-35誘導的神經PC12細胞損傷的影響及機制

楊淑珍＊，趙晶媛#（新鄉醫學院第二附屬醫院精神七科，河南新鄉 453002）

目的：研究阿立哌唑對Aβ淀粉樣蛋白（Aβ25-35）誘導的神經PC12細胞損傷的影響及其機制。方法：將PC12細胞隨機分為正常對照組、模型組（20 μmol/LAβ25-35）和阿立哌唑低、中、高濃度組（5、10、20 μmol/L阿立哌唑+20 μmol/LAβ25-35），加入含相應藥物的培養基培養48 h，每組6個復孔。MTT法檢測細胞活力（光密度值），Hoechst染色法檢測細胞凋亡情況，分光光度法檢測細胞中天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-9活性，Western blot法檢測細胞中B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）蛋白表達及蛋白激酶B（Akt）磷酸化水平。結果：與正常對照組比較，模型組細胞光密度值降低，凋亡率增加，Caspase-3、Caspase-9活性和Bax蛋白表達均增強，Bcl-2、PI3K蛋白表達和Akt磷酸化水平均降低（P＜0.01）。與模型組比較，阿立哌唑低、中、高濃度組細胞光密度值增加，凋亡率減少，Caspase-3、Caspase-9活性減弱，Bcl-2、PI3K蛋白表達和Akt磷酸化水平均增加；阿立哌唑中、高濃度組細胞Bax蛋白表達減弱（P＜0.05或P＜0.01）。結論：阿立哌唑可明顯抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡，其作用可能與激活PI3K/Akt信號通路有關。

阿立哌唑；Aβ淀粉樣蛋白；神經PC12細胞；凋亡；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又稱老年癡呆癥，是一種中樞神經系統變性疾病，臨床主要表現為認知功能障礙、行為及活動能力下降或異常。其中腦內及海馬區Aβ淀粉樣蛋白（Amyloid β-protein，Aβ）沉積是AD主要病理變化之一，已成為AD治療藥物的主要靶點之一[1-2]。PC12細胞是來源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤的一種常用的神經細胞，其形態、結構及生化功能與神經元類似，常作為研究神經細胞生長、凋亡、發育及功能的細胞培養模型。Aβ誘導的PC12細胞損傷模型已被廣泛使用于AD等神經性疾病的探討研究[3-4]。阿立哌唑是一種非典型抗精神病藥物，能通過激活多巴胺受體改善精神分裂癥狀及抑郁癥。同時臨床研究證實，阿立哌唑單獨用藥或者聯用其他非典型抗精神病藥物對AD患者療效顯著[5-6]。基礎研究也證實，阿立哌唑對PC12細胞活力或者1-甲基-4-苯基吡啶離子（MMP+）誘導的PC12細胞損傷具有顯著影響[7-8]，但具體作用機制尚未見報道。所以，本研究擬以Aβ25-35誘導PC12細胞損傷，探討阿立哌唑的抗損傷作用及具體機制。

1 材料

1.1 儀器

Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；ChemiDocTMXRS型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；AF6000型熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

阿立哌唑口腔崩解片（浙江大冢制藥有限公司，批號：140910A，規格：5 mg/片）；Aβ25-35（美國Sigma公司，批號：A4559，純度：＞95%）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批號：P0010）、小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）、HRP標記山羊抗小鼠IgG（H+L）、Hoechst染色試劑盒（碧云天生物技術研究所）；兔抗B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化（p-）Akt單克隆抗體（美國Epitmics公司）；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-9活性檢測試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；DMEM培養基（美國Gibco公司）。

1.3 細胞

大鼠神經PC12細胞購于中國科學院上海細胞庫，培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中。

2 方法

2.1 分組與給藥

按文獻[9-11]方法將試驗分為正常對照組、模型組（20 μmol/L Aβ25-35）和阿立哌唑低、中、高濃度組（5、10、20 μmol/L阿立哌唑+20 μmol/LAβ25-35），加入含相應藥物的DMEM培養基培養48 h，每組6個復孔。

2.2 細胞活力的檢測

將處于生長對數期的PC12細胞消化，調細胞密度為5×103mL－1，接種于96孔板，每孔200 μL，于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h。按“2.1”項下分組給藥，繼續培養48 h，每孔加MTT（5 mg/mL）20 μL，4 h后棄上清，并每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL培養10 min。用酶標儀于570 nm波長處測定光密度（OD值），以此評價細胞活力。

2.3 細胞凋亡的檢測

將融合度為80%的PC12細胞消化，調細胞密度為1×104mL－1，接種于6孔板，每孔1 mL，于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h，按“2.1”項下分組給藥，繼續培養48 h。然后按照Hoechst染色試劑盒說明書進行染色，固定，顯微鏡下觀察細胞核，發亮發白即是凋亡細胞。利用Image J軟件計算各組細胞的細胞凋亡率（%）。

2.4 細胞中Caspase-3、Caspase-9活性的檢測

將融合度為80%的PC12細胞消化，調細胞密度為1×104mL－1，接種于6孔板，每孔1 mL，于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h。按“2.1”項下分組給藥，繼續培養48 h，然后按照Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒說明書操作，用酶標儀于405 nm波長處測定吸光度，計算活性。

2.5 凋亡相關因子和PI3K/Akt信號通路相關因子的檢測

將融合度為80%的PC12細胞消化，調細胞密度為1×104mL－1，接種于6孔板，每孔1 mL，于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h。按“2.1”項下分組給藥，繼續培養48 h，收集細胞，加入RIPA裂解液，裂解30 min。以離心半徑為15 cm、10 000 r/min離心10 min，收獲蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品煮沸變性10 min，上樣，進行十二烷基硫酸鈉凝膠電泳1～2 h，濕法轉膜30～40 min，加入一抗（兔抗Bax、Bcl-2、PI3K、Akt、p-Akt單克隆抗體，小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋比例均為1∶100）孵育，4℃過夜。漂洗后，加入二抗[HRP標記山羊抗兔IgG（H+L）、HRP標記山羊抗小鼠IgG（H+L），稀釋比例均為1∶500]，室溫孵育1～2 h。漂洗并滴加增強化學發光（ECL）液后，在凝膠成像系統中曝光，用Quantity One軟件統計各抗體條帶灰度值。以Bcl-2、Bax、PI3K與GADPH灰度值的比值表示對應蛋白的相對表達量，以p-Akt與Akt灰度值的比值表示Akt的磷酸化水平。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 細胞活力的測定結果

與正常對照組比較，模型組細胞的OD值降低（P＜0.01）。與模型組比較，阿立哌唑各濃度組細胞的OD值均增加（P＜0.01）。與阿立哌唑低濃度組比較，阿立哌唑中、高濃度組細胞的OD值均增加（P＜0.01）；與阿立哌唑中濃度組比較，阿立哌唑高濃度組細胞的OD值增加（P＜0.01）。各組細胞活力的測定結果見表1。

3.2 細胞凋亡率的測定結果

與正常對照組比較，模型組細胞凋亡率增加（P＜0.01）。與模型組比較，阿立哌唑各濃度組細胞凋亡率減少（P＜0.05或P＜0.01）。與阿立哌唑低濃度組比較，阿立哌唑中、高濃度組細胞凋亡率減少（P＜0.01）；與阿立哌唑中濃度組比較，阿立哌唑高濃度組細胞凋亡率減少（P＜0.01）。各組細胞凋亡情況的Hoechst染色圖見圖1，凋亡率測定結果見表1。

表1 各組細胞活力和凋亡率的測定結果（±s，n＝6）Tab 1 Results of cell viability and apoptotic rate in each group（±s，n＝6）

表1 各組細胞活力和凋亡率的測定結果（±s，n＝6）Tab 1 Results of cell viability and apoptotic rate in each group（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿立哌唑低濃度組比較，ΔΔP＜0.01；與阿立哌唑中濃度組比較，▲▲P＜0.01Note：vs.normal control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aripiprazole low-concentration group，ΔΔP＜0.01；vs.aripiprazole medium-concentration group，▲▲P＜0.01

組別正常對照組模型組阿立哌唑低濃度組阿立哌唑中濃度組阿立哌唑高濃度組細胞凋亡率，% 5.38±0.54 38.46±2.54＊＊27.72±2.56#17.48±1.74##ΔΔ9.59±0.98##ΔΔ▲▲OD值0.67±0.06 0.34±0.03＊＊0.43±0.05##0.52±0.05##ΔΔ0.63±0.06##ΔΔ▲▲

圖1 各組細胞凋亡情況（Hoechst染色，×200）Fig1 Cell apoptosis in each group（Hoechst staining，×200）

3.3 細胞中Caspase-3、Caspase-9活性的測定結果

與正常對照組比較，模型組細胞中Caspase-3、Caspase-9活性增強（P＜0.01）。與模型組比較，阿立哌唑各濃度組細胞中Caspase-3、Caspase-9活性減弱（P＜0.05或P＜0.01）。與阿立哌唑低濃度組比較，阿立哌唑中、高濃度組細胞中Caspase-3、Caspase-9活性減弱（P＜0.01）；與阿立哌唑中濃度組比較，阿立哌唑高濃度組細胞中Caspase-3、Caspase-9活性減弱（P＜0.01）。各組細胞中Caspase-3、Caspase-9活性的測定結果見表2。

3.4 細胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表達和Akt磷酸化水平的測定結果

與正常對照組比較，模型組細胞中Bcl-2、PI3K蛋白表達減弱，Bax蛋白表達增強，p-Akt/Akt降低（P＜0.01）。與模型組比較，阿立哌唑各濃度組細胞中Bcl-2、PI3K蛋白表達增強和p-Akt/Akt增加，阿立哌唑中、高濃度組細胞中Bax蛋白表達減弱（P＜0.05或P＜0.01）。與阿立哌唑低濃度組比較，阿立哌唑中、高濃度組細胞中Bcl-2、PI3K蛋白表達增強和p-Akt/Akt增加，Bax蛋白表達減弱（P＜0.01）；與阿立哌唑中濃度組比較，阿立哌唑高濃度組細胞中Bcl-2、PI3K蛋白表達增強和p-Akt/ Akt增加，Bax蛋白表達減弱（P＜0.01）。各組細胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表達及Akt磷酸化水平的電泳圖見圖2，測定結果見表3。

表2 各組細胞中Caspase-3、Caspase-9活性的測定結果（±s，n＝6）Tab 2 Results of the activities of Caspase-3 and Caspase-9 in cell of each group（±s，n＝6）

表2 各組細胞中Caspase-3、Caspase-9活性的測定結果（±s，n＝6）Tab 2 Results of the activities of Caspase-3 and Caspase-9 in cell of each group（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿立哌唑低濃度組比較，ΔΔP＜0.01；與阿立哌唑中濃度組比較，▲▲P＜0.01Note：vs.normal control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aripiprazole low-concentration group，ΔΔP＜0.01；vs. aripiprazole medium-concentration group，▲▲P＜0.01

組別正常對照組模型組阿立哌唑低濃度組阿立哌唑中濃度組阿立哌唑高濃度組Caspase-9 0.29±0.02 2.38±0.24＊＊1.95±0.20#1.23±0.12##ΔΔ0.74±0.07##ΔΔ▲▲Caspase-3 0.48±0.04 3.27±0.30＊＊2.72±0.26##2.08±0.20##ΔΔ1.23±0.13##ΔΔ▲▲

圖2 各組細胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表達及Akt磷酸化水平的電泳圖Fig 2 Electrophoresis of protein expressions of Bax，Bcl-2 and PI3K and the phosphorylation of Akt in cell of each group

表3 各組細胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表達及Akt磷酸化水平的測定結果（±s，n＝6）Tab 3 Determination results for protein expressions of Bax，Bcl-2 and PI3K and the phosphorylation ofAkt in cell of each group（±s，n＝6）

表3 各組細胞中Bax、Bcl-2、PI3K蛋白表達及Akt磷酸化水平的測定結果（±s，n＝6）Tab 3 Determination results for protein expressions of Bax，Bcl-2 and PI3K and the phosphorylation ofAkt in cell of each group（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿立哌唑低濃度組比較，ΔΔP＜0.01；與阿立哌唑中濃度組比較，▲▲P＜0.01Note：vs.normal control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aripiprazole low-concentration group，ΔΔP＜0.01；vs.aripiprazole medium-concentration group，▲▲P＜0.01

組別正常對照組模型組阿立哌唑低濃度組阿立哌唑中濃度組阿立哌唑高濃度組p-Akt/Akt 0.83±0.08 0.08±0.01＊＊0.19±0.02##0.37±0.03##ΔΔ0.38±0.03##ΔΔBax/GADPH 0.15±0.01 1.34±0.13＊＊1.32±0.05 0.88±0.09##ΔΔ0.40±0.04##ΔΔ▲▲Bcl-2/GADPH 1.29±0.12 0.21±0.02＊＊0.37±0.03#0.93±0.10##ΔΔ1.14±0.10##ΔΔ▲▲PI3K/GADPH 0.62±0.06 0.18±0.01＊＊0.30±0.03##0.41±0.04##ΔΔ0.42±0.37##ΔΔ

4 討論

本研究首先通過MTT法檢測阿立哌唑對Aβ25-35誘導的PC12細胞的影響，結果表明阿立哌唑能濃度依賴性地提高PC12細胞活力，進一步的Hoechst染色結果也證實阿立哌唑能抵抗Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡，由此提示阿立哌唑能抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡，并促進細胞存活。

細胞凋亡由多種信號通路所調控，PI3K/Akt信號通路就是其中之一，具有“抗凋亡通路”之稱。當PI3K被激活后，可促使3，4-二磷酸脂酰肌醇（PIP2）轉化為3，4，5-三磷酸脂酰肌醇（PIP3），后者招募并激活Akt，活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白如Bax、Bcl-2及Caspase表達，進而調節細胞的增殖、分化及凋亡等過程。Bcl-2是最常見的抑凋亡蛋白，能與促凋亡蛋白Bax形成異源二聚體，從而作用于線粒體膜上，促進細胞色素C及Caspase-3與Caspase-9的釋放，最終誘導細胞凋亡。已有研究證實，Aβ能促使神經元細胞Bcl-2表達減弱、Bax表達增強，使Bcl-2/Bax比值降低[12]；同時Aβ25-35可誘導PC12細胞中Bcl-2表達下調、Bax表達上調、Caspase-3活性增強[10，13]；另外Aβ可降低AD大鼠腦組織中PI3K/Akt信號通路活性，并伴隨著Caspase-3活性的增強[14]。而Xian YF等[15]、劉玲等[10]報道PI3K/Akt信號通路的激活可以拮抗Aβ誘導的PC12細胞凋亡。因此本研究進一步探討阿立哌唑對Aβ25-35誘導的PC12細胞中PI3K/Akt信號通路激活情況，Bax、Bcl-2表達量及Caspase-3、Caspase-9活性的影響，結果表明，阿立哌唑能顯著上調PI3K及Bcl-2表達，提高Akt磷酸化水平，降低Bax表達及Caspase-3、Caspase-9活性。這提示阿立哌唑可通過激活PI3K/Akt信號通路，調節信號通路下游凋亡相關蛋白表達或活性，進而改善Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷。

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（編輯：鄒麗娟）

Effects of Aripiprazole on PC12 Cell Injury Induced by Aβ25-35and Its Mechanism

YANG Shuzhen，ZHAO Jingyuan（Dept.Seven of Psychiatry，the Second Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Henan Xinxiang 453002，China）

OBJECTIVE：To study the effects of aripiprazole on PC12 cell injury induced by amyloid β-protein（Aβ25-35）and its mechanism.METHODS：PC12 cells were randomized into normal control group，model group（20 μmol/L Aβ25-35），aripiprazole low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups（5，10，20 μmol/L aripiprazole+20 μmol/L Aβ25-35）.These groups were cultured with culture medium containing relevant medicine for 48 h，with 6 wells in each group.The viability（optical density value）of PC12 cell was measured by MTT assay，and PC12 cell apoptosis was measured by Hoechst staining.The activities of Caspase-3 and Caspase-9 were determined by spectrophotometry.The protein expression of Bcl-2，Bax and PI3K and the phosphorylation of Akt were assayed by Western blot assay.RESULTS：Compared with normal control group，optical density value of model group was decreased while apoptotic rate was increased；the activities of Caspase-3 and Caspase-9，and the protein expression of Bax were increased；the protein expression of Bcl-2 and PI3K，the phosphorylation of Akt were decreased（P＜0.01）.Compared with model group，optical density value of aripiprazole low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups were increased，while apoptotic rate and the activities of Caspase-3 and Caspase-9 were decreased；the protein expression of Bcl-2 and PI3K and the phosphorylation of Akt were enhanced；while the protein expression of Bax were decreased in aripiprazole medium-concentration and high-concentration groups（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Aripiprazole can suppress cell apoptosis of PC12 cell induced by Aβ25-35，which is related to activating PI3K/Akt signal pathway.

Aripiprazole；Amyloid β-protein；Nerve PC12 cell；Apoptosis；PI3K/Akt signal pathway

R361+.3

A

1001-0408（2017）01-0053-05

2016-04-23

2016-06-17）

＊主治醫師，碩士。研究方向：神經病學。E-mail：jsprincess11@ 163.com

#通信作者：副主任醫師，碩士。研究方向：精神病學。電話：0373-3373606

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.14