苗藥大烏泡葉提取物的體外抑菌作用考察Δ

劉 瑤，蔡 進，陳 瑞，劉珈伲，劉麗娜，黃 靜（貴州醫科大學藥學院，貴陽 550025）

苗藥大烏泡葉提取物的體外抑菌作用考察Δ

劉 瑤＊，蔡 進，陳 瑞，劉珈伲，劉麗娜，黃 靜#（貴州醫科大學藥學院，貴陽 550025）

目的：考察苗藥大烏泡葉提取物的體外抑菌作用。方法：將大烏泡葉煎煮水提物和80%醇提物均制備成質量濃度為200 mg/mL的藥液，并以氨芐青霉素和氟康唑為陽性對照（50 mg/mL），采用管碟法測定其對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌、普通變形桿菌、白色念珠菌、新型隱球菌的抑菌作用。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取80%醇提物，得到相應部位萃取物（50 mg/mL）后，采用管碟法考察其對上述7種菌株的抑菌作用；篩選出具有抑菌作用的部位及對藥物敏感的試驗菌株，并分別采用微量肉湯稀釋法和瓊脂培養基平板法測定其最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。結果：大烏泡葉的水提物幾乎無抑菌活性，80%醇提物對各菌株則表現出不同程度的抑制作用，對5種細菌的抑菌作用優于對2種真菌；大烏泡葉80%醇提物的乙酸乙酯及正丁醇萃取部位表現出良好的抑菌作用，石油醚和水層部位幾乎沒有抑菌作用，各萃取部位對真菌均未見抑制作用；大烏泡葉80%醇提物對5種細菌的MIC、MBC分別在6.25～12.5、12.5～25 mg/mL之間，其乙酸乙酯部位的MIC、MBC分別為3.13、6.25 mg/mL，其正丁醇部位的MIC、MBC分別在3.13～6.25、6.25～12.5 mg/mL之間。結論：苗藥大烏泡葉的80%醇提物及其乙酸乙酯、正丁醇萃取部位對細菌具有明顯的體外抑菌作用。

大烏泡葉；水提物；醇提物；不同部位；體外抑菌作用；最低抑菌濃度；最低殺菌濃度

大烏泡葉為薔薇科懸鉤子屬植物大烏泡（Rubus multibracteatus Levl.et Vant.）的干燥葉，主要產于四川、云南、貴州等地。其味微苦，性涼，具有清熱解毒、祛風除濕、涼血、止血、接骨的功效，民間多用于治療痢疾、腹瀉、風濕痹痛、咳血、婦女倒經、骨折等[1]。大烏泡葉為民間常用藥，目前對其研究報道主要集中在化學成分[2]及含量測定[3]上。本課題組前期研究發現，大烏泡葉的80%醇提物具有較強的鎮痛、抗炎活性[4]，但對于其提取物的體外抑菌活性卻未見文獻報道。為了進一步明確大烏泡葉的體外抑菌作用，本研究對大烏泡葉的水提物、80%醇提物及有效提取物的不同極性萃取部位進行抑菌試驗，為充分利用大烏泡藥材資源提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

SW-CJ-1FD凈化工作臺（廣州瑞智科學儀器公司）；KJ14麥氏比濁管（北京哲成科技有限公司）；EL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品、試劑與培養基

氨芐青霉素原料藥（北京索萊寶科技有限公司，批號：104D036，純度：≥98%）；氟康唑原料藥（貴陽凱信生物工程有限公司，批號：20141203，純度：98%）；乙醇（95%）、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜（DMSO）等均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為蒸餾水。

水解酪蛋白（M-H）瓊脂培養基（批號：20140708）、M-H肉湯培養基（批號：20130808）、沙氏瓊脂培養基（批號：20140328）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 藥材

大烏泡葉于2015年3月由筆者購自貴州省凱里市，經貴州醫科大學龍慶德教授鑒定為真品。自然晾干后粉碎為粗粉，儲藏備用。

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、表皮葡萄球菌[CMCC（B）26069]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、痢疾志賀菌[CMCC（B）51105]、普通變形桿菌[CMCC（B）49027]等5種細菌和白色念珠菌[ATCC10231]、新型隱球菌[CBS6901]等2種真菌的菌株均由貴州醫科大學感染與免疫學實驗室提供。

2 方法與結果

2.1 菌種的活化及菌懸液的制備

按無菌操作法，將斜面保存的各標準菌株接種在相應的瓊脂培養基上復蘇（細菌用M-H瓊脂培養基，37℃條件下培養18～24 h；真菌用沙氏瓊脂培養基，37℃條件下培養24～48 h）[5-6]，轉接1次，用滅菌生理鹽水調整菌懸液濃度與0.5麥氏比濁管相當，此時菌懸液菌濃度約為1.5×108CFU/mL。再按100倍稀釋法取少量菌懸液用滅菌生理鹽水稀釋至1.5×106CFU/mL，備用。

2.2 大烏泡葉水提物和80%%醇提物體外抑菌作用考察

2.2.1 藥液的制備 （1）大烏泡葉水提物：取大烏泡葉粗粉500 g，以10倍量水充分浸泡30 min，煎煮3次，每次3 h，用紗布將煎煮液濾過。合并3次濾液，蒸干，得大烏泡葉水提物（得率為24.6%）。將提取物以無菌生理鹽水溶解，制成質量濃度為200 mg/mL的藥液，備用。（2）大烏泡葉80%醇提物：取大烏泡葉粗粉500 g，以10倍量80%乙醇回流提取3次，每次3 h，減壓抽濾提取液。合并3次抽濾液，旋轉蒸發儀回收乙醇，蒸干，得大烏泡葉80%醇提物（得率為18.6%）。將提取物用10%DMSO-無菌生理鹽水溶解，制成質量濃度為200 mg/mL的藥液，備用。（3）對照藥液的制備：將氨芐青霉素原料藥和氟康唑原料藥用無菌生理鹽水溶解，制成質量濃度分別為50、300 mg/L的藥液，備用。試驗前所有藥液均用0.22 μm濾膜過濾除菌。

2.2.2 大烏泡葉水提物和80%醇提物的體外抑菌作用考察 采用管碟法[7-9]。按無菌操作要求，分別吸取100 μL各菌懸液至相應培養基表面（細菌用M-H瓊脂培養基，真菌用沙氏瓊脂培養基），無菌棉簽涂布均勻，室溫下放置2～3 min，等距分散放置滅菌牛津杯（外徑為8 mm、內徑6 mm、高為10 mm），靜置10～15 min使其固定。向每個小杯中加入100 μL制備好的相應藥液，室溫下放置2 h使藥液擴散，每個平板均設置3個試藥組、1個藥物對照組（細菌用氨芐青霉素，真菌用氟康唑）和1個10%DMSO-無菌生理鹽水的溶劑對照組，將各培養皿置于37℃恒溫培養箱中培養（細菌培養18～24 h，真菌培養24～48 h），取出觀察抑菌圈，并測量抑菌圈直徑。每種菌株平行操作3次。結果判定按《藥理實驗方法學》標準[6]：抑菌圈直徑＜10 mm為抗藥，10 mm為輕度敏感，11～15 mm為中度敏感，16～20 mm為高度敏感。抑菌圈直徑測定結果見表1。

表1 大烏泡葉水提物和80%%醇提物的抑菌圈直徑測定結果（±s，n＝3，mm）Tab 1 Diameters of antibacterial circle for aqueous extract and 80%%ethanol extract from R.multibracteatus leaves（±s，n＝3，mm）

表1 大烏泡葉水提物和80%%醇提物的抑菌圈直徑測定結果（±s，n＝3，mm）Tab 1 Diameters of antibacterial circle for aqueous extract and 80%%ethanol extract from R.multibracteatus leaves（±s，n＝3，mm）

注：“/”為未進行試驗；“N”為無抑菌圈Note：“/”means not tested；“N”means no antibacterial circle

樣品水提物80%醇提物氨芐青霉素氟康唑10%DMSO-無菌生理鹽水金黃色葡萄球菌9.15±0.32 20.98±0.43 38.38±0.30表皮葡萄球菌15.35±0.41 23.95±0.49 16.23±0.21大腸埃希菌9.95±0.24 16.80±0.39 15.90±0.21痢疾志賀菌9.8±0.37 17.80±0.33 16.85±0.30普通變形桿菌10.12±0.28 17.83±0.31 19.37±0.42 /N /N /N /N /N白色念珠菌N 9.60±0.29 / 15.25±0.30 N新型隱球菌N 9.03±0.34 / 16.20±0.24 N

由表1可見，大烏泡葉水提物幾乎無抑菌活性，只有表皮葡萄球菌對其表現出中度敏感，抑菌圈直徑為（15.35±0.41）mm。大烏泡葉80%醇提物對5種細菌均表現出抑菌活性，其中對表皮葡萄球菌的抑制效果最佳，抑菌圈直徑為（23.95±0.49）mm，對2種真菌抑制效果不佳；且大烏泡葉80%醇提物對表皮葡萄球菌和痢疾志賀菌的抑制作用強于對照藥物氨芐青霉素?？梢姶鬄跖萑~80%醇提物抑菌作用強于大烏泡葉水提物，故本研究進一步考察大烏泡葉80%醇提物不同極性部位的體外抑菌作用。

2.3 大烏泡葉80%%醇提物不同極性部位的體外抑菌作用考察

2.3.1 大烏泡葉80%醇提物不同極性部位萃取物的制備 取大烏泡葉80%醇提物用水混懸后，先用石油醚萃取，剩余藥液再用乙酸乙酯萃取，最后用正丁醇萃取，余下藥液為水層。用旋轉蒸發儀將不同極性溶劑減壓回收，真空干燥，分別得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水層部位（得率分別為1.5%、2.8%、3%、6%）。將不同極性部位分別用10%DMSO-無菌生理鹽水溶解，制備成提取物質量濃度均為50 mg/mL的藥液，備用。試驗前所有藥液均用0.22 μm濾膜過濾除菌。

2.3.2 體外抑菌活性測定 取大烏泡葉80%醇提物不同極性部位藥液，按照“2.2.2”項下方法測定其對5種細菌和2種真菌的抑菌圈大小。測定結果見表2。

表2 大烏泡葉80%%醇提物不同極性部位的抑菌圈直徑測定結果（±s，n＝3，mm）Tab 2 Diameters of antibacterial circle for different polar fractions of 80%%ethanol extract from R. multibracteatus leaves（±s，n＝3，mm）

表2 大烏泡葉80%%醇提物不同極性部位的抑菌圈直徑測定結果（±s，n＝3，mm）Tab 2 Diameters of antibacterial circle for different polar fractions of 80%%ethanol extract from R. multibracteatus leaves（±s，n＝3，mm）

注：“/”為未進行試驗；“N”為無抑菌圈Note：“/”means not tested；“N”means no antibacterial circle

樣品石油醚部位乙酸乙酯部位正丁醇部位水層部位氨芐青霉素氟康唑10%DMSO-無菌生理鹽水金黃色葡萄球菌7.17±0.32 15.1±0.51 14.6±0.44 8.07±0.35 39.5±0.27表皮葡萄球菌7.65±0.22 15.58±0.48 16.28±0.31 12.27±0.28 16.73±0.29大腸埃希菌N 14.5±0.39 13.5±0.35 6.70±0.11 16.7±0.22痢疾志賀菌7.30±0.37 14.13±0.53 13.73±0.47 6.77±0.13 16.70±0.24普通變形桿菌N 14.85±0.50 15.95±0.47 9.25±0.19 20.95±0.30白色念珠菌新型隱球菌NNNN/ NNNN/ /N /N /N /N /N 15.53±0.27 N 16.0±0.31 N

由表2可見，大烏泡葉80%醇提物的石油醚、水層部位幾乎無抑菌活性；乙酸乙酯、正丁醇部位對5種細菌均表現出良好抑菌效果，且均對表皮葡萄球菌的抑菌作用最強；各提取部位對2種真菌均未見抑菌活性。故本研究進一步考察大烏泡葉80%醇提物及其乙酸乙酯、正丁醇部位對5種細菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。

2.4 大烏泡葉80%%醇提物及其乙酸乙酯、正丁醇部位對5種細菌的MIC和MBC考察

2.4.1 MIC的測定 采用微量肉湯稀釋法[6-9]。按無菌操作法，取一次性無菌96孔板，每排12孔各加入100 μL M-H肉湯培養基，再吸取100 μL藥液（大烏泡葉80%醇提物及其乙酸乙酯、正丁醇部位）加入第1孔，混勻后吸取100 μL加入第2孔，如此連續倍比稀釋至第10孔，第10孔中吸取100 μL棄去，此為試驗組；第11孔不加試藥，以便觀察培養基是否適合菌株生長，為生長對照組；第12孔不加菌液，以便觀察培養基否被污染，為培養基對照組。吸取100 μL濃度為1.5×106CFU/mL的菌懸液，依次加入到上述1～11孔中，充分混勻，此時各孔菌濃度為7.5×105CFU/mL；吸取100 μL M-H肉湯培養基加入到第12孔中，充分混勻。將96孔微孔板加蓋置于37℃恒溫培養箱中培養18～24 h，取出觀察菌株生長情況。在黑色背景光源下，與生長對照孔中生長特性相同如肉湯渾濁或孔底出現渾濁，則判斷為有菌生長。以無菌生長所對應的最低藥物質量濃度記為該藥的MIC。每種菌株平行操作3次。測定結果詳見表3、表4、表5。

表3 大烏泡葉80%%醇提物對5種菌株的MIC測定結果（n＝3）Tab 3 MIC of 80%%ethanol extract from R.multibracteatus leaves for 5 kinds of bacterial strains（n＝3）

表4 大烏泡葉80%%醇提物乙酸乙酯部位對5種菌株的MIC測定結果（n＝3）Tab 4 MIC of ethyl acetate fraction of 80%%ethanol extract from R.multibracteatus leaves for 5 kinds of bacterial strains（n＝3）

表5 大烏泡葉80%%醇提物正丁醇部位對5種菌株的MIC測定結果（n＝3）Tab 5 MIC of n-butyl alcohol fraction of 80%%ethanol extract from R.multibracteatus leaves for 5 kinds of bacterial strains（n＝3）

結果顯示，黑色光源背景下，生長對照組肉湯渾濁，提示培養基適合細菌生長；培養基對照組肉湯澄清，說明培養基并未受到污染。仔細觀察各孔狀態，可得知大烏泡葉80%醇提物對表皮葡萄球菌的MIC為6.25 mg/mL，對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌、普通變形桿菌的MIC均為12.5 mg/mL；其乙酸乙酯部位對上述5種細菌的MIC均為3.13 mg/mL；其正丁醇部位對普通變形桿菌的MIC為3.13 mg/mL，對其余4種細菌的MIC均為6.25 mg/mL。

2.4.2 MBC的測定 采用瓊脂培養基平板法[6]分別從“2.4.1”項下未見細菌生長的孔中吸取100 μL培養液，分別接種至M-H瓊脂培養基平皿中，用無菌棉簽均勻涂布，置37℃恒溫培養箱中培養18～24 h。用活菌計數法檢查平板上菌落，以平均菌落數小于5的最小稀釋度的藥物質量濃度記為該藥的MBC。每種菌株平行操作3次。測定結果詳見表6。

表6 大烏泡葉80%%醇提物及其乙酸乙酯、正丁醇部位的MBC測定結果（n＝3）Tab 6 MBC of 80%%ethanol extract from R.multibracteatus leaves and its ethyl acetate and n-butyl alcohol fractions（n＝3）

由表6可知，大烏泡葉80%醇提物對表皮葡萄球菌的MBC為12.5 mg/mL，對其余4種細菌的MBC均為25 mg/mL；其乙酸乙酯部位對5種細菌的MBC均為6.25 mg/mL；其正丁醇部位對大腸埃希菌、痢疾志賀菌的MBC均為12.5 mg/mL，對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、普通變形桿菌的MBC均為6.25 mg/mL。

3 討論

本試驗選擇了氨芐青霉素和氟康唑作為陽性對照藥物。其中，氨芐青霉素為廣譜抗生素，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有很好的抑菌效果；氟康唑為抗真菌藥物，對真菌的抑制作用良好。實驗中所有藥物的質量濃度由筆者根據查閱的相關文獻[10-11]以及對前期預試驗結果歸納整理后設定。

抑菌活性測定結果顯示，大烏泡葉水提物幾乎未見抑菌作用，而80%醇提物對各菌株的抑菌作用顯著強于水提物，且對5種細菌的抑制效果優于對2種真菌，其中又對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果優于對其他細菌。80%醇提物的4個不同極性部位的抑菌活性測定結果顯示，石油醚及水層部位幾乎無抑菌活性，乙酸乙酯及正丁醇部位表現出良好抑菌效果，但4個萃取部位對真菌均無抑制作用。以上結果提示，大烏泡葉80%醇提物及其乙酸乙酯、正丁醇萃取部位為抑菌有效部位，均對細菌有較好的抑制效果，但對真菌抑制效果不佳。MIC測定結果顯示，大烏泡葉80%醇提物的乙酸乙酯部位對5種細菌的抑制作用最強，其次為正丁醇部位，80%醇提物的抑制效果最弱。MBC測定結果進一步表明其乙酸乙酯部位抑菌效果最強。以上結果提示，大烏泡葉抑菌活性成分主要為中等極性的脂溶性組分，80%醇提物的乙酸乙酯部位可以作為抑菌活性部位應用，從中尋找大烏泡葉的抑菌活性成分是今后研究的方向。

綜上所述，大烏泡葉80%醇提物及其乙酸乙酯、正丁醇萃取部位具有明顯的體外抑菌作用，該結論為大烏泡葉這一民間常用藥的合理開發利用提供了一定的實驗依據，但對于其抑菌有效部位的具體活性成分以及抑菌機制仍有待進一步研究。

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Study on in vitro Antibacterial Effect of Extracts from Miao Medicine Rubus multibracteatus Leaves

LIU Yao，CAI Jin，CHEN Rui，LIU Jiani，LIU Lina，HUANG Jing（School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China）

OBJECTIVE：To investigate in vitro antibacterial effect of extracts from Miao medicine Rubus multibracteatus leaves.METHODS：The aqueous extract and 80%ethanol extracts from R.multibracteatus leaves were used to prepare solution with mass concentration of 200 mg/mL.Using ampicillin and fluconazol as positive control（50 mg/mL），cup plate method was used to determine antibacterial effects of the extracts from R.multibracteatus leaves to Staphylococcus aureus，Staphylococcus epidermidis，Escherichia coli，Shigella dysenteriae，Proteus vulgaris，Candida albicans and Cryptococcus neoformans.The petroleum ether，acetic ether and n-butyl alcohol were used to extract 80%ethanol extracts in turns.After obtaining relevant extracts（50 mg/mL），cup plate method was used to investigate antibacterial effects of them to above 7 bacterial strains.The parts with antibacterial effects and bacterial strains sensitive to drug were screened.Micro-broth dilution method and agar culture medium plate method were used to determine minimum inhibitory concentration（MIC）and minimum bactericidal concentration（MBC）.RESULTS：The aqueous extract of R.multibracteatus leaves almost had no inhibitory effect while 80%ethanol extract showed different degrees of antibacterial effect to tested bacterial strains，and it also had higher activity against 5 bacterial stains than 2 fungus.The ethyl acetate and n-butyl alcohol fractions of 80%ethanol extracts showed good effect while the petroleum ether and water layer fractions had no antibacterial effect，and all the fractions of 80%ethanol extracts showed no inhibitory effect on fungus.To 5 bacterial stains，MIC and MBC of 80%ethanol extract were 6.25-12.5，12.5-25 mg/mL，those of ethyl acetate fractions were 3.13，6.25 mg/mL and those of n-butyl alcohol fraction were 3.13-6.25，6.25-12.5 mg/mL，respectively.CONCLUSIONS：80%ethanol extract of Miao medicine R.multibracteatus leaves and its ethyl acetate and n-butyl alcohol fractions have obvious in vitro antibacterial effect to bacteria.

Rubus multibracteatus leaves；Aqueous extract；Ethanol extract；Different fractions；in vitro antibacterial effect；Minimum inhibitory concentration；Minimum bactericidal concentration

R285；R965

A

1001-0408（2017）01-0072-04

2016-07-04

2016-10-25）

（編輯：林 靜）

貴州省科技計劃課題（No.黔科合ZY〔2011〕3005）

＊碩士研究生。研究方向：藥物制劑新劑型與新工藝、藥動學。E-mail：574080864@qq.com

#通信作者：副教授，碩士。研究方向：藥物質量控制、藥動學。電話：0851-88416159。E-mail：huangjgy@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.19