苗藥理氣活血滴丸對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用Δ

李堯鋒，徐 劍，陳向云，彭 芳，田紫平，熊仕芳，朱 璨，楊長福，陳云志，張永萍#（.貴陽中醫學院基礎醫學院，貴陽 55005；.貴陽中醫學院藥學院，貴陽 55005；.貴州益佰制藥股份有限公司，貴陽550008）

苗藥理氣活血滴丸對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用Δ

李堯鋒1＊，徐 劍2，陳向云1，彭 芳1，田紫平3，熊仕芳3，朱 璨1，楊長福1，陳云志1，張永萍2#（1.貴陽中醫學院基礎醫學院，貴陽 550025；2.貴陽中醫學院藥學院，貴陽 550025；3.貴州益佰制藥股份有限公司，貴陽550008）

目的：研究苗藥理氣活血滴丸對心肌缺血再灌注損傷（MIRI）模型大鼠的保護作用。方法：將60只大鼠隨機分為假手術組、模型組、辛伐他汀組（陽性對照，40 mg/kg）和理氣活血滴丸低、中、高劑量組（43.75、87.50、175.00 mg/kg），每組10只。各給藥組大鼠每天ig相應藥物1次，連續10 d；假手術組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水。末次給藥45 min后，除假手術組外其余各組大鼠均復制MIRI模型。復灌后監測大鼠心律失常情況；采用蘇木精-伊紅染色觀察心肌組織病理學變化；采用酶動力學法測定血清中心肌酶[肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）]活性；采用酶聯免疫吸附法測定血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）含量。結果：與假手術組比較，模型組大鼠心律失常程度較高，心肌組織損傷嚴重，血清中CK、LDH活性及TNF-α、IL-6含量均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀組和理氣活血滴丸中、高劑量組大鼠心律失常程度降低，心肌組織病理損傷得到改善，血清中CK、LDH活性及TNF-α、IL-6含量均顯著降低（P＜0.01），且理氣活血滴丸高劑量組與辛伐他汀組各指標水平接近（P＞0.05）。結論：理氣活血滴丸對MIRI模型大鼠具有一定保護作用，其機制可能與減少心肌細胞心肌酶的漏出、降低血清中TNF-α和IL-6含量、抑制炎性損傷有關。

苗藥；理氣活血滴丸；心肌缺血再灌注損傷；心肌酶；腫瘤壞死因子α；白細胞介素6；大鼠

對急性心肌梗死患者采用再灌注治療是改善心肌缺血的有效辦法，然而隨著血流的暢通，部分患者在再灌注后會出現室性早搏、室性心動過速和室顫等現象，甚至發生死亡，即發生了心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）[1]。治療MIRI的藥物主要有他汀類、血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥、硝酸酯類等，但常引起不同程度的副作用[2]。中藥因具有毒副作用小，多靶點、多環節作用的優點，備受國內、外醫學研究者青睞[3]。

理氣活血滴丸是貴州益佰制藥股份有限公司生產的新藥，是根據貴州苗族民間驗方和傳統中醫藥理論研制而成，組方包括苗藥米槁精油（又名大果木姜子油）、薤白、川芎、艾片等藥材，具有溫陽寬胸、理氣活血的功效，臨床試驗證明其治療冠心病、心絞痛等療效較好[4]，但是其具體作用機制尚不清楚。故本研究通過建立大鼠MIRI模型，通過觀察大鼠心律失常情況，心肌組織形態學變化，血清中心肌酶[肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）]活性及炎性細胞因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素6（IL-6）]含量的變化，探討其對MIRI模型大鼠的保護作用機制。

1 材料

1.1 儀器

BL-420F生物機能實驗系統、HX-101E動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；BX53顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）；GLAMOUR 1600全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2 藥品與試劑

理氣活血滴丸（貴州益佰制藥股份有限公司，批號：20140802，規格：25 mg/丸）；辛伐他汀片（杭州默沙東制藥有限公司，批號：141107，規格：20 mg/片）；CK、LDH測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20151003、20151011）；大鼠TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，批號：20151110、20151104）。

1.3 動物

健康SD大鼠60只，♂，體質量250～280 g，購自長沙天勤生物技術有限公司[動物生產許可證號：SCXK（湘）2014-0010]。

2 方法

2.1 分組與給藥

將60只SD大鼠適應性飼養1周后隨機分為6組，每組10只，分別為假手術組、模型組、辛伐他汀組（陽性對照組，40 mg/kg，劑量根據參考文獻[5]和預實驗結果設定）和理氣活血滴丸低、中、高劑量組[43.75、87.50、175.00 mg/kg，分別根據人臨床用量的3.5、7、14倍劑量換算而得]。各給藥組大鼠均按1 mL/100 g ig給藥（溶劑均為生理鹽水），每天1次，連續10 d；假手術組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水。

2.2 MIRI大鼠模型的建立

大鼠術前禁食、禁水12 h，末次給藥45 min后，ip 25%烏拉坦麻醉，仰臥固定于手術臺上。做氣管插管，連接動物呼吸機（頻率為80～90次/min，潮氣量為2 mL/100 g，呼、吸比為3∶2）。接肢體導聯線，連接生物機能實驗系統，記錄Ⅱ導聯心電圖。將左胸部備皮、消毒，在第三、第四肋骨間剪開胸膛，打開心包，暴露心臟，造模組（除假手術組外的其余組）大鼠用5號縫合絲線結扎左冠狀動脈前降支中上部位，假手術組大鼠只穿線不結扎，然后將心臟送回胸腔。以左室前壁呈紫紺或藍紫色及同步心電圖顯示QRS波幅度升高、ST段抬高為結扎成功標志。結扎30 min后，松開絲線，復灌60 min，建立MIRI大鼠模型[6]。

2.3 心律失常評價

給大鼠接肢體導聯線，連接生物機能實驗系統，監測大鼠體表Ⅱ導聯心電圖，記錄再灌注20 min后室性早搏、室性心動過速及室顫情況。參照Ravingerova T等[7]的方法進行室性心律失常（Ventricular arrhythmia，VA）評分，評分標準見表1。

表1 心律失常評分標準Tab 1 Criteria for arrhythmia score

2.4 標本取材

再灌注60 min后，大鼠腹主動脈取血，置于采血管中，以4℃、2 500 r/min（離心半徑為13.5 cm）離心15 min，無菌分離血清，－20℃保存，待測。然后摘取心臟，用生理鹽水洗凈血漬，切取左心室，用濾紙吸干，置于4%多聚甲醛溶液中固定，待測。

2.5 心臟組織病理觀察

取出置于固定液中的心臟，流水沖洗，然后縱向切取心肌組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋、切片（厚度為6μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色后顯微鏡下觀察大鼠心臟組織病理變化。

2.6 生化指標檢測

取血清，冰上融化后，采用酶動力學法檢測血清中CK、LDH活性；采用ELISA雙抗體夾心法檢測血清中TNF-α、IL-6含量。試驗操作均按照試劑盒說明書進行。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 理氣活血滴丸對MIRI模型大鼠心律失常的影響

與假手術組比較，模型組大鼠發生心律失常時間較早、持續時間長，頻繁發生室性早搏、室性心動過速和室顫，且有1只大鼠死亡，這表明模型組大鼠心律失常程度較高。與模型組比較，理氣活血滴丸低劑量組大鼠心律失常現象未見明顯改善；理氣活血滴丸中、高劑量組和辛伐他汀組大鼠心律失常程度顯著減輕，以室性早搏和室性心動過速為主，且理氣活血滴丸對大鼠心律失常的改善作用呈劑量依賴性，結果見表2。

表2 各組大鼠室性心律失常評分結果Tab 2 Results of ventricular arrhythmias score of rats in each group

3.2 理氣活血滴丸對MIRI模型大鼠心肌組織形態學變化的影響

假手術組大鼠心肌細胞結構完整，肌纖維排列整齊，細胞核形態正常，心肌細胞無水腫；模型組大鼠心肌組織結構損壞嚴重、出現壞死現象，肌纖維排列紊亂、發生腫脹或斷裂，胞漿空泡狀改變，細胞核有固縮現象，有炎癥細胞浸潤。與模型組比較，理氣活血滴丸低劑量組大鼠心肌組織病理學無明顯改善；理氣活血中劑量組大鼠心肌細胞結構稍顯正常，肌纖維排列稍整齊，胞漿輕度腫脹，無核固縮現象；理氣活血高劑量組和辛伐他汀組大鼠心肌細胞結構完整，肌纖維排列整齊，細胞無腫脹、無核固縮、無炎癥細胞浸潤等現象，病理變化得到明顯改善。以上結果也表明，理氣活血滴丸對MIRI模型大鼠心肌組織病理學改變的改善作用具有劑量依賴性，結果見圖1。

3.3 理氣活血滴丸對MIRI模型大鼠血清中CK、LDH活性的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清中CK、LDH活性顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，除理氣活血滴丸低劑量組大鼠血清中CK、LDH活性降低不顯著外，其余各給藥組大鼠血清中CK、LDH活性均顯著降低（P＜0.01），且理氣活血滴丸降低血清中CK、LDH活性的作用具有劑量依賴性，結果見表3。

圖1 各組大鼠心肌組織形態學觀察結果（HE，×200）Fig 1 The morphological observation result in myocardial tissue of rats in each group（HE，×200）

表3 各組大鼠血清中CK、LDH活性及TNF-α、IL-6含量測定結果（±s，n＝10）Tab 3 The activities of CK and LDH and the contents of TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（±s，n＝10）

表3 各組大鼠血清中CK、LDH活性及TNF-α、IL-6含量測定結果（±s，n＝10）Tab 3 The activities of CK and LDH and the contents of TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（±s，n＝10）

注：與假手術組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別假手術組模型組辛伐他汀組理氣活血滴丸低劑量組理氣活血滴丸中劑量組理氣活血滴丸高劑量組IL-6，pg/mL 61.75±4.72 230.49±3.61＊＊99.32±5.03##218.80±3.42 124.02±3.79##95.69±4.52##CK，U/L 284.84±20.01 534.62±25.63＊＊367.20±18.59##510.39±29.32 400.72±21.28##380.16±19.93##LDH，U/L 2 588.35±201.19 3 874.86±213.73＊＊2 931.49±230.01##3 701.52±208.62 3 125.65±230.31##2 986.26±205.21##TNF-α，pg/mL 46.56±2.47 180.84±1.73＊＊68.32±3.50##162.78±2.83 80.21±2.20##67.45±1.86##

3.4 理氣活血滴丸對MIRI模型大鼠血清中TNF-α、IL-6含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TNF-α、IL-6含量均有所降低，除理氣活血滴丸低劑量組外差異均有統計學意義（P＜0.01），且理氣活血滴丸降低血清中TNF-α、IL-6含量的作用具有劑量依賴性，結果見表3。

4 討論

急性心肌缺血是臨床上常見的危重病癥之一，進行再灌注治療可明顯降低其病死率。然而潛在的再灌注期心肌細胞損傷、凋亡、壞死是影響其預后的主要因素，且其發生機制也比較復雜。大量研究表明，MIRI的原因主要有活性氧增多、鈣超載、炎性損傷和細胞凋亡等[8-11]。辛伐他汀不僅能有效降脂，而且具有抗氧化、抑制炎癥反應和抗心肌細胞凋亡等作用，可從多層次、多靶點防治MIRI[12-13，5]，因此在本研究中以其為陽性對照藥。

再灌注期心肌細胞受到嚴重損傷，細胞膜通透性增加，心肌酶（如CK、LDH等）漏出入血。因此，監測心律失常嚴重情況及血清中CK、LDH活性水平是反映心肌細胞損傷程度的重要指標。本實驗結果發現，心肌缺血再灌注期大鼠心律失常程度較高，血清中CK、LDH活性升高，說明建模成功。理氣活血滴丸預處理后能降低再灌注時心律失常的嚴重程度，提示該藥有效地改善了心肌組織的功能。且理氣活血滴丸預處理后降低了MIRI大鼠血清中CK、LDH活性，提示該藥能有效減少心肌細胞心肌酶CK和LDH的漏出，保護了心肌細胞膜的完整性，減輕了心肌細胞損傷。

另外，研究表明再灌注期TNF-α、IL-6的合成和釋放量會增加，兩者在血清中的含量與心肌細胞損傷程度有一定相關性[14-15]。TNF-α是一種具有多種生物效應的細胞因子，參與多種組織再灌注損傷。TNF-α是在機體處于應激狀態下，由單核細胞、巨噬細胞以及內皮細胞等產生的，能激活一系列級聯反應，誘導中性粒細胞和血管內皮細胞表達表面黏附因子，促使中性粒細胞聚集在缺血區，加重缺血缺氧程度，釋放多種促炎性因子，同時也促進活性氧產生，加重再灌注期心肌組織的損傷[16]。IL-6處于炎癥反應的樞紐位置，可促使中性粒細胞流入缺血心肌組織，誘導中性粒細胞與心肌細胞結合，損傷心肌[17]。本實驗結果表明，理氣活血滴丸預處理后能顯著降低大鼠血清中TNF-α和IL-6含量，說明該藥減少了TNF-α和IL-6的表達，抑制了中性粒細胞聚集。另外，組織病理學實驗也表明理氣活血滴丸預處理能改善心肌組織結構，減輕心肌細胞細胞質的腫脹程度，減輕心肌細胞的炎性損傷，且具有劑量依賴性。

綜上所述，理氣活血滴丸對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，能改善心肌組織病理學變化，減少心肌細胞心肌酶CK、LDH的漏出，降低血清中TNF-α和IL-6含量。這提示其對MIRI的防治作用可能與抗炎性損傷有關，但其具體作用機制有待進一步探究。

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Protective Effect of Miao Medicine Liqi Huoxue Dropping Pills on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury Model Rats

LI Yaofeng1，XU Jian2，CHEN Xiangyun1，PENG Fang1，TIAN Ziping3，XIONG Shifang3，ZHU Can1，YANG Changfu1，CHEN Yunzhi1，ZHANG Yongping2（1.School of Basic Medicine，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China；2.School of Pharmacy，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China；3.Guizhou Yibai Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guiyang 550008，China）

OBJECTIVE：To investigate the protective effect of Miao medicine Liqi huoxue dropping pills on myocardial ischemia-reperfusion injury（MIRI）model rats.METHODS：60 rats were randomized into sham operation group，model group，simvastatin group（positive control，40 mg/kg）and Liqi huoxue dropping pills low-dose，medium-dose and high-dose groups（43.75，87.50，175.00 mg/kg），with 10 rats in each group.Treatment groups were given relevant medicine intragastrically once a day for 10 days.Sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically.45 min after last administration，MIRI model was induced in those groups except for sham operation group.The situation of cardiac arrhythmia in rats was monitored after reperfusion.The myocardium tissue morphology was observed by hematoxylin-eosin（HE）staining；the activity of myocardial[creatine kinase（CK）and lactate dehydrogenase（LDH）]in serum were measured by enzyme dynamics method；the contents of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-6（IL-6）in serum were detected by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.RESULTS：Compared with sham operation group，rats in model group suffered from more serious arrhythmia and myocardial tissue damaged，and the activities of CK and LDH and the contents of TNF-α and IL-6 were increased significantly（P＜0.01）.Compared with model group，arrhythmia degrees of rats were decreased in simvastatin group and Liqi huoxue dropping pills medium-dose and high-dose groups，and pathological changes of myocardial tissue was improved，while the activities of CK and LDH and the contents of TNF-α and IL-6 in serum were decreased significantly（P＜0.01）；those indexes of Liqi huoxue dropping pills high-dose group were close to those of simvastatin group（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Liqi huoxue dropping pills havethe protective effect on MIRI model rats，and its mechanism may be related to decreasing myocardial enzyme leaking of cardiac muscle cell，decreasing the serum contents of TNF-α and IL-6 and inhibiting the inflammatory injury.

Miao medicine；Liqi huoxue dropping pills；Myocardial ischemia-reperfusion injury；Myocardial enzyme；Tumor necrosis factor-α；Interleukin-6；Rats

R285

A

1001-0408（2017）01-0076-04

2016-08-30

2016-10-30）

（編輯：林 靜）

貴陽中醫學院博士科研項目啟動基金（No.中醫研〔2015〕017）；貴陽中醫學院中西醫結合基礎學科資助項目（No.黔學位合字ZDXK〔2016〕25號）

＊講師，博士。研究方向：中藥防治心血管疾病。E-mail：lyfengcxy2010@163.com

#通信作者：教授，碩士生導師。研究方向：中藥、民族藥新制劑與新劑型開發。電話：0851-5652056。E-mail：zgygpg@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.20