Box-Behnken響應面法優化大蒜油提取工藝Δ

康冰亞，劉瑞新，桂新景，段曉穎，李學林，徐立然（.河南中醫學院第一附屬醫院國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室，鄭州 450000；.河南中醫學院藥學院，鄭州 450046；.河南中醫學院第一附屬醫院艾滋病研究中心，鄭州 450000）

Box-Behnken響應面法優化大蒜油提取工藝Δ

康冰亞1＊，劉瑞新1#，桂新景2，段曉穎1，李學林1，徐立然3（1.河南中醫學院第一附屬醫院國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室，鄭州 450000；2.河南中醫學院藥學院，鄭州 450046；3.河南中醫學院第一附屬醫院艾滋病研究中心，鄭州 450000）

目的：優化大蒜油的提取工藝。方法：以大蒜油提取率為指標，在單因素試驗基礎上采用Box-Behnken響應面法對水蒸氣蒸餾法提取大蒜中大蒜油的發酵時間、料液比、發酵溫度等條件進行優化研究，對優化工藝進行驗證試驗。結果：最優提取工藝為發酵時間4.5 h、料液比1∶7、發酵溫度55℃。驗證試驗中大蒜油平均提取率為0.32%（RSD＝1.43%，n＝3），實測值與預測值之間的相對誤差為0.06%。結論：采用Box-Behnken響應面法優化所得大蒜油提取工藝簡便、合理、可行，可為大蒜油工業化大生產提供參考。

大蒜油；水蒸氣蒸餾法；Box-Behnken響應面法；提取工藝；優化

大蒜（Allium sativum L.）是百合科多年生草本植物大蒜的干燥鱗莖，主要活性成分為大蒜油，是蒜中所有含硫化合物的總稱[1]。大蒜油被稱之為天然抗生素，國內外已有諸多相關產品問世，現被廣泛應用于醫藥、保健品及食品等領域。

目前，大蒜油的提取工藝主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑浸出法和超臨界二氧化碳萃取法。溶劑浸出法是一種相對比較溫和的方法，但是其不足之處是提取物中其他的可溶性雜質含量偏高，將大蒜油進一步提純的操作較復雜且難度大[2]。超臨界二氧化碳萃取法可直接獲得純凈、高品質、高得率的大蒜油，具有生產周期短、安全可靠等優點，但其對設備的要求也較高，相應地提高了提取成本，產業化生產相對比較困難，目前主要處于實驗室研究階段，不便用于大規模生產[3]。水蒸氣蒸餾法具有設備簡單、成本低、穩定性好等特點[4]，是最常用的工業生產化方法之一。本試驗采用水蒸氣蒸餾法提取大蒜油，以大蒜油提取率為指標，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面法分析并優化水蒸氣蒸餾法提取大蒜油的工藝條件，并在工藝參數與大蒜油提取率之間建立數學模型關系，為將來的規?；a提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

DS-1型高速組織搗碎機（上海標本模型廠）；揮發油提取器（北京新科實驗室玻璃儀器有限公司）；ABZDHW-2000型電熱套（北京中興偉業儀器有限公司）。

1.2 藥材

大蒜（于2016年3月27日購自鄭州市丹尼斯超市，產地：河南）。

2 方法與結果

2.1 提取方法

稱取一定量的去皮大蒜，放入組織搗碎機中，加入適量蒸餾水，搗碎成細顆粒狀，置于圓底燒瓶中，常壓加一定量蒸餾水，在特定溫度下浸泡發酵一定時間。連接揮發油提取器，提取一定時間，收集提取物，并加適量石油醚（60～90℃）萃取。精密讀取大蒜油體積，計算其提取率[提取量（mL）/大蒜質量（g）×100%]。

2.2 單因素試驗初步篩選影響因素與水平

查閱文獻[5-6]，分別設置發酵時間（h）、料液比（大蒜質量-加水量，m∶V）、發酵溫度（℃）和蒸餾時間（h）4個因素，每個因素設置5個水平，以大蒜油提取率為指標對影響因素進行初步篩選。

2.2.1 發酵時間 設置發酵溫度為25℃、蒸餾時間為2 h、料液比為1∶4，考察發酵時間為1、2、3、4、5 h時對大蒜油提取率的影響，結果見圖1A。

圖1 各因素對大蒜油提取率的影響Fig 1 Effects of various factors on extraction rate of garlic oil

由圖1A可知，隨著發酵時間的延長，大蒜油提取率呈現上升的趨勢；當發酵時間為4 h時，大蒜油提取率達到峰值，之后呈現下降趨勢。故以發酵時間4 h為宜。

2.2.2 料液比 設置蒸餾時間為2 h、發酵溫度為25℃、發酵時間為1 h，考察料液比分別為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8時對大蒜油提取率的影響，結果見圖1B。

從圖1B可知，當料液比為1∶4、1∶5時，大蒜油提取率未發生明顯變化；當料液比設為1∶6時，大蒜油提取率呈現明顯的上升趨勢；當料液比設為1∶7、1∶8時，大蒜油提取率又略呈現先下降、后又微升的趨勢。故選擇料液比1∶6為宜。

2.2.3 發酵溫度 設置蒸餾時間為2 h、料液比為1∶4、發酵時間為1 h，考察發酵溫度為15、25、35、45、55℃時對大蒜油提取率的影響，結果見圖1C。

從圖1C可知，隨著發酵溫度的升高，大蒜油的提取率呈現先升后降的趨勢；當溫度達到35℃時，大蒜油提取率最高，之后略呈現下降的趨勢。故選擇發酵溫度35℃為宜。

2.2.4 蒸餾時間 設置發酵溫度為25℃、料液比為1∶4、發酵時間為1 h，考察蒸餾時間為1、2、3、4、5 h對大蒜油提取率的影響，結果見圖1D。

由圖1D可知，各蒸餾時間不同引起的大蒜油提取率的變化不太明顯，蒸餾前3 h呈現略微上升的趨勢，之后呈現略微下降的趨勢。從試驗結果來看，雖然蒸餾3 h比蒸餾2 h大蒜油提取率略高，但隨著蒸餾時間的延長能耗增大。因此，從節約成本及降低能耗的角度考慮，確定蒸餾時間為2 h，并不再進行優化。

上述單因素結果表明，初步篩選的較優提取條件為發酵時間4 h、料液比1∶6、發酵溫度35℃、蒸餾時間2 h。最終選取發酵時間3～5 h、料液比1∶5～1∶7、發酵溫度15～55℃進行后續響應面法設計，優化大蒜油提取工藝參數。

2.3 Box-Behnken響應面法優化大蒜油提取工藝

選取發酵時間（X1）、料液比（X2）、發酵溫度（X3）為考察變量，大蒜油提取率（Y）為響應值，采用Box-Behnken design（BBD）試驗設計方案，進行3因素3水平的響應面分析對工藝參數進行優化，總共設計17組試驗點。因素與水平見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

應用Design Expert 6.0.5軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，得到Y對X1、X2、X3之間的二次多項回歸方程為：Y＝0.31+0.036X1－0.030X2+0.054X3－0.092X12－ 0.060X22－ 0.047X32+7.500×10－3X1X2+ 0.055X1X3+0.083X2X3，剔除不顯著項后 Y＝0.31+ 0.036X1－0.030X2+0.054X3－0.092X12－0.060X22－0.047X32+0.055X1X3+0.083X2X3。由方程可知，各因素對大蒜油提取率的影響大小排序為X3＞X1＞X2，即發酵溫度＞發酵時間＞料液比。對上述回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表2 試驗設計與結果Tab 2 Design and results of test

表3 回歸模型的方差分析結果Tab 3 Variance analysis result of regression model

從表3可以看出，回歸方程顯著性檢驗P＜0.05，表明響應面回歸模型達到顯著水平。模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率[7]，表4中失擬項的P為0.535 4＞0.100，說明該方程對試驗結果擬合良好。模型中X3、X12、X2X3項具有顯著性，表明各個自變量與因變量之間不是簡單的線性關系，而具有一定的交互作用。對各因素繪制曲面圖和等高線圖，以直觀地反映各因素的交互作用對響應值的影響以及最優條件下各因素的取值結果，詳見圖2。

由圖2可見，X2與X3的曲線較陡，且等高線為橢圓形，表明二者之間具有顯著性交互作用；X1與X3、X1與X2的曲線比較平緩，等高線基本為圓形，表明兩兩之間交互作用不顯著，與方差分析結果一致。

圖2 各因素對大蒜油提取率的曲面圖和等高線圖Fig 2 Surface plot and contour map for various factors to extraction rate of garlic oil

根據Box-Behnken響應面法試驗所得結果和二次多項回歸方程，采用Design Expert 6.0.5軟件擬合可得最優工藝條件為發酵時間4.5 h、料液比1∶7、發酵溫度55℃。此條件下大蒜油提取率預測值為0.34%。

平行、精密稱定3份大蒜，每份500 g，根據優化工藝對3批樣品進行提取工藝驗證試驗。結果大蒜油平均提取率為0.32%（RSD＝1.43%，n＝3），與預測值基本接近（相對誤差為0.06%），表明預測值與真實值之間有較好的一致性，進一步驗證了模型的可靠性。

3 討論

3.1 提取方法

大蒜油中主要藥效成分是大蒜素，經現代醫學研究證明，大蒜具有的廣譜殺菌作用主要是由大蒜素引起的[8]，而如何將大蒜油從大蒜中有效提取出來尚有一定的難度，這主要是由于大蒜素是在蒜酶作用下轉化產生的，而在提取操作中蒜酶極易失活。本試驗采用水蒸氣蒸餾法，雖與其他方法相比有一定優勢，但亦有不足之處，如蒸餾的高溫可能會導致一部分有效成分揮發或分解。如果在制備大蒜油的過程中采用保持低溫或隔絕空氣等特殊的生產技術，如低溫萃取或冷凍干燥技術，可能會提高制備的大蒜油的質量，這將是本課題組下一步的研究方向。

3.2 各因素對提取率變化的影響原因分析

3.2.1 發酵時間 在單因素試驗中，隨著發酵時間的延長，大蒜油提取率呈現先上升后下降。原因可能是大蒜中的蒜氨酸與蒜氨酸酶在細胞破碎后發生了酶解反應所致。隨著發酵時間的延長，蒜氨酸酶與蒜氨酸充分反應接觸，直至反應完全，生成一種名為硫代亞磺酸酯的化合物，該化合物不穩定，很快變成一系列的分子[9]，同時大蒜素的生成則減少。

3.2.2 料液比 在單因素試驗中，隨著料液比的增大，大蒜油提取率呈現先平衡、再上升后又略下降、再微上升的趨勢。原因可能是當料液比為1∶4～1∶5時，由于水量不夠，不能夠充分浸潤大蒜，產生的蒸氣量不夠，從而導致大蒜油提取不完全；而當繼續增大液體的比例時（1∶7～1∶8），可能又對大蒜產生了稀釋作用，從而導致其提取率略微下降。

3.2.3 發酵溫度 在單因素試驗中，隨著發酵溫度的增加，大蒜油的提取率呈現先升后降的趨勢。原因可能是大蒜油的產生是一個酶促反應，而蒜氨酸酶的活性受溫度的影響，當蒜漿的發酵處于一定溫度時，蒜氨酸酶的活力最高，大蒜揮發油的轉化速量最快，產量也就較高[10]；而溫度低時，酶的活性小，產品轉化時間長；溫度太高，偏離酶活性最適期，產品產量又降低。

3.3 試驗設計方法的選取

由于本試驗中的3個自變量因素皆為連續性變量，對于連續性變量的多因素試驗，Box-Behnken響應面法是一種較適合的分析方法。Box-Behnken響應面法通過非線性模型擬合得出的最優提取條件更接近客觀實際，避免了傳統正交設計和均勻設計法的不足，具有試驗精度高、模型預測性好的優點，并已用于優化各種中藥的提取以及制劑處方工藝的試驗中[11-13]。而本試驗的驗證試驗結果也表明，采用Box-Behnken響應面法優化大蒜油提取工藝簡單、準確、可行。

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Optimization of the Extraction Technology of Garlic Oil by Box-Behnken Response Surface Method

KANG Bingya1，LIU Ruixin1，GUI Xinjing2，DUAN Xiaoying1，LI Xuelin1，XU Liran3（1.Third Grade Laboratory，State Administration for TCM，the First Affiliated Hospital of Henan Traditional Chinese Medicine University，Zhengzhou 450000，China；2.College of Pharmacy，Henan University of TCM，Zhengzhou 450046，China；3. AIDS Research Center，the First Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of garlic oil.METHODS：Using extraction rate of garlic oil as index，based on single factor test，Box-Behnken response surface method was used to optimize conditions of steam distillation method for the extraction of garlic as fermentation time，solid to liquid ratio，fermentation temperature and the verification test were made for the optimized technology.RESULTS：The optimal extraction technology was as follows as fermentation time of 4.5 h，solid to liquid ratio of 1∶7，fermentation temperature of 55℃.The average extraction rate of garlic oil in verification test was 0.32%（RSD＝1.43%，n＝3）；the relative error between the measured value and predicted value was 0.06%.CONCLUSIONS：Box-Behnken response surface method is simple，reasonable and feasible to optimize the extraction technology of garlic oil，which can provide a scientific basis for industrial production.

Garlic oil；Steam distillation；Box-Behnken response surface method；Extraction technology；Optimization

R284.2

A

1001-0408（2017）01-0103-04DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.27

2016-06-12

2016-08-12）

（編輯：劉 萍）

國家中醫藥管理局國家中醫藥臨床研究基地業務建設科研專項課題（No.JDZX2015162）；鄭州市科技局項目（No.CZSYJJ-14012）

＊主管中藥師，碩士。研究方向：中藥制劑。電話：0371-66233639。E-mail：kangby2008@163.com

#通信作者：副主任藥師，博士。研究方向：中藥制劑及分析。電話：0371-66233639。E-mail：liuruixin7@163.com