降解組測序技術及其研究進展

李法君

(山東省濰坊科技學院 262700)

微RNA(microRNA，miRNA) 是一類長度為19～25個核苷酸(nt)(一般為22個)的內源性非編碼小分子單鏈RNA，具有高度保守性、時序性和組織特異性。通常，miRNA能與靶基因的mRNA序列部分或完全配對，在轉錄后水平上抑制mRNA翻譯或誘導mRNA剪切降解。作為21世紀生命科學領域的重大發現之一，miRNA參與了動植物體內許多生化過程。迄今，人們已能通過轉錄組測序技術從生物體中獲取大量的miRNA信息。然而，達成人類對miRNA生物學功能的利用還有賴于對其靶基因調控的實現。因此，如何確定miRNA的靶基因已經成為當前亟待解決的課題。傳統miRNA靶基因的確定一般是通過生物信息學進行預測[1]，但是該方法無法區分預測靶基因的真偽，所測得的結果必須經實驗去偽存真，這就極大地影響了靶基因的探索效率[2]；在一些特殊情況下，miRNA與靶基因間存在較高錯配，該預測方法可能會丟失許多真實的靶基因。因此，生物信息學預測并不能全面、快速、真實地鑒定miRNA的靶基因。動物體中miRNA多通過與靶基因的3′-端的非翻譯區結合來抑制翻譯的進行。與之不同，植物體中的miRNA則是通過剪切的方式將目標mRNA降解。因此，降解組測序(degradome sequencing)技術就成為確定植物miRNA靶基因的有力工具。

1 降解組測序技術

降解組測序技術又稱為大規模平行末端分析(parallel analysis of RNA ends，PARE)，是一種新的鑒定miRNA靶基因的實驗方法。它綜合了高通量測序技術與生物信息學分析兩者的優勢，對植物體中由 miRNA 介導而產生的mRNA降解片段進行深度測序分析，從而高效、準確地篩選出與之相對應的靶基因。降解組測序技術包括兩個主要環節，即降解組文庫的構建與測序以及數據分析。基本原理[2，3]如下：植物體內絕大多數的miRNA通過剪切作用來調控靶基因的表達，剪切位點通常發生在miRNA與mRNA互補的第10或第11位核苷酸上。靶基因經過剪切后被分為兩個部分，即5′-端剪切片段和3′-端剪切片段，其中3′-端剪切片段包括自由的5′-端單磷酸和3′-端poly(A)尾巴。RNA連接酶利用5′-端單磷酸將3′-端剪切片段與特定的5′-端接頭序列連接，形成一新的單鏈RNA序列。利用oligo(dt)引物將該新的單鏈RNA序列反轉錄成cDNA序列，用PCR技術將其擴增，并利用限制性內切酶Mme I對上述PCR產物進行酶切，從而得到長度為20～21 nt的片段。將這些片段與3′-端雙鏈DNA接頭連接并繼續進行PCR擴增，最終得到一個包含miRNA的靶基因3′-端剪切片段的文庫(降解組文庫)。隨后對該文庫進行高通量測序，并從測得的序列中去除接頭序列，便可獲得目的序列。利用CleaveLand、starBase、SeqTar、SoMART 和PAREsnip等分析軟件對所測序列進行深入比對，可以直觀地發現在mRNA序列的某個位點會出現一個波峰，而此處正是候選的miRNA剪切位點。其后在波峰的上、下游各選取15 nt的核苷酸序列，這樣就得到一個大約30 nt的序列。將該序列反向互補并與測序物種的miRNA數據庫比對，符合要求的匹配即為潛在miRNA的靶基因。

2 降解組測序技術研究進展

2.1 miRNA生成機制的調控 研究表明，初級miRNA(pri-miRNA)經過剪切便成為成熟的miRNA。在此過程中，有些pri-miRNA可被自身成熟的miRNA剪切加工，且大多數切割位點并不發生在10～11nt處，其中的分子機制還不完全明確。Meng等[4]通過對水稻的降解組數據研究發現，miR-161和miR-445d可以對自身的前體序列進行切割。原因可能在于，miRNA和前體序列之間通過這種反饋機制來調控miRNA的表達，從而與靶基因的表達相一致，進而調控靶基因的表達。雖然miRNA在生物體內的生成機制已有大量的研究報道，但尚有許多具體的環節不清楚。降解組測序技術將有助于從一個新的視角詮釋miRNA的生物學生成機制。

2.2 miRNA靶基因的確定 2008年，German等[5]最先在擬南芥中運用降解組測序技術確定了miRNA的靶基因。在100個已經在擬南芥中證實的miRNA靶基因中，分別在野生型(WT)和xrn4突變型擬南芥花組織的降解組中檢測到了94個和98個靶基因，初步證實了降解組測序在篩選miRNA基因方面的高效性；而在124個尚未確定的靶基因中，在WT和xrn4降解組中分別發現了31個和42個。為了確定上述基因是否真的是miRNA的靶基因，進而從中選取13個未確定基因用傳統的RACE方法進行驗證，結果顯示其中的12個是miRNA的靶基因。Liu等[6]在不同發育時期的玉米穗中，通過降解組測序技術發現102個miRNA存在141個靶基因。上述結果表明，相比以前的生物信息學預測，降解組測序技術能高效準確地鑒定miRNA的靶基因。

2.3 miRNA家族靶基因具體位點的確定 miRNA功能具有高度的保守性，同一個miRNA家族的不同miRNA個體可能會作用于相同的靶基因，但具體的作用位點可能不盡相同。MADS-box 基因是一類在植物中廣泛存在的同源異型基因，參與調控花和果實發育及成熟的多個過程。作為重要的轉錄因子，MADS-box 基因的表達受miR-444家族的調控。miR-444家族包括miR-444-b.1、miR-444-b.2和miR-444-c.2等多個亞型。Li等[7]在水稻中通過降解組測序技術表明，雖然不同miR-444亞型切割的基因相同，但是其切割后產生的序列片段數目卻不同，原因在于不同亞型的切割位點不同。由miR-444-b.2/c.2介導的對Os02g36924靶基因(MADS-box基因的亞型之一)C1位點的切割所產生的序列片段數量最多，而miR-444-b.1在該基因C2位點上的切割豐度卻遠低于C1位點。這一結果清楚地表明：降解組測序在確定miRNA家族靶基因具體切割位點方面具有獨特的技術優勢。

2.4 抗逆性研究 近來，降解組測序技術也被用在植物的抗逆性研究中。Wang等[8]通過構建谷子干旱脅迫的miRNA轉錄組文庫，發現了81個保守的和72個新發現的miRNA序列。進一步的降解組測序分析表明，它們所對應的靶基因分別為56和26個，為研究谷子在干旱脅迫下的基因調控網絡奠定了基礎。Chen等[9]在低氮脅迫的楊樹中發現60個miRNAs(39個保守的，13個非保守的和8個新發現的)分別調控64個靶基因的表達，為研究楊樹的低氮脅迫提供了基本的miRNA數據。此外，科研人員還運用降解組測序研究了大麥的干旱脅迫、小麥的寒冷脅迫、玉米的低氮脅迫和胡楊的鹽堿脅迫等相關抗逆性過程。

2.5 生長發育研究 miRNA在生物體的生長發育過程中發揮著重要的調控作用。Song等[10]通過構建大豆種子不同發育時期miRNA轉錄組文庫和降解組文庫發現，207個注釋的和26個新發現的miRNA的靶基因分別為145個和25個。其中新發現的miRNA Soy-25的靶基因為沉默抑制因子3基因，揭示大豆種子發育過程中的miRNA生物合成受反饋調控。由此可見，降解組測序為闡明大豆的種子發育機制提供了有力的技術支持。現在降解組測序已經廣泛應用于植物生長發育過程的研究，如草莓的果實衰老、龍眼的胚胎發育、棉花的體胚發育、葡萄的開花結果和西紅柿的果實成熟等。

3 展望

隨著轉錄組測序技術的發展，植物體內不同組織和不同發育時期的mRNA序列相繼得以明確。因此，基因組學中有關基因功能的研究勢必將從單個基因功能的確定過渡到調控機制的研究。作為真核生物中普遍存在的轉錄后調控機制，miRNA主要通過調控靶基因的表達來實施自己的生物學功能。因此，靶基因的鑒定就顯得格外重要。作為一項新興的技術，降解組測序技術為準確鑒定miRNA的靶基因提供了一個有效的技術平臺，已經在植物中得以應用，并取得了眾多的科研成果。有趣的是，近來降解組測序技術也被應用于動物體miRNA靶基因的確定。Park等[11]在模式動物線蟲中運用此技術證實，miR-249的靶基因為ZK637.6的轉錄本。Yang等[12]在日本囊對蝦中運用降解組測序技術發現，miR-1和let-7的靶基因分別為核酸內切逆轉錄酶基因和跨膜蛋白14C-like基因。由此可見，降解組測序對于動物體miRNA靶基因的確定也具有一定的意義。相信隨著不同物種miRNA序列的逐漸豐富，降解組測序將會發揮更大的作用，兩者的有機結合將有助于解析生物體的轉錄后調控機制，進而為研究基因的調控網絡奠定理論基礎。