噬菌體抗體庫技術概述

蔡盡忠

(福建省廈門華廈學院檢驗科學與技術系 361021)

20世紀80年代中期，Smith等[1]在絲狀噬菌體分子生物學研究的基礎上提出了噬菌體展示技術(phage display technique)。1989年，英國Winter研究組和美國Lernard研究組同時創建了噬菌體抗體庫技術(phage antibody library technique)。1990年，McCafferty[2]在絲狀噬菌體表面成功展示具有抗原結合能力的抗體片段，進一步推動了噬菌體抗體庫技術的研究。

噬菌體抗體庫技術是利用PCR擴增出抗體的全套可變區基因，利用噬菌體表面展示技術把Fab段或單鏈抗體(ScFv)表達在噬菌體表面，并進一步通過“吸附—洗脫—擴增”方法篩選和富集特異性抗體的技術[3]。這一技術將表型與基因型聯系在一起，將抗體識別抗原的能力與噬菌體擴增的能力結合在一起，是一項極為高效的表達、篩選體系，在生物技術領域極具應用前景[4]。本文綜述噬菌體抗體庫的構建原理、技術過程及應用。

1 噬菌體抗體庫的技術原理

噬菌體展示技術是一種基因表達和篩選的技術，即將外源蛋白分子或多肽的基因克隆到絲狀噬菌體基因組中，與噬菌體外膜蛋白融合表達，展示在噬菌體顆粒的表面[5]。這樣，外源蛋白或多肽的基因型與表型統一在同一噬菌體顆粒內，通過表型篩選就可以獲得相應的編碼基因。

雖有多種外殼蛋白被用于噬菌體展示，但目前文獻報道的用于抗體分子展示的主要是PⅢ蛋白和PⅧ蛋白[6]。PⅢ蛋白位于噬菌體顆粒的尾端，含有406個氨基酸殘基，由3個結構域組成，每個噬菌體含有3～5個副本。3個結構域由甘氨酸富集的連接肽串聯起來，在結構上具有高度易變性和靈活性，故其N端可以插入較大的外源片段而不影響噬菌體的結構和功能，而且融合表達的外源片段還可保持相對獨立的結構構象[7]。PⅧ蛋白是噬菌體的主要外殼蛋白，含有32個氨基酸殘基，每個噬菌體含有3～5個副本。其C端與噬菌體DNA結合，構成噬菌體包膜的內壁，N端游離在外，可容納較小的外源片段。

噬菌體展示的抗體是在噬菌體表面表達的抗體分子Fab或ScFv，這種表達是通過Fab或ScFv與載體即噬菌體外殼蛋白(PⅢ或PⅧ蛋白)形成融合蛋白而完成。其特點是噬菌體載體既可以識別相應抗原并與之相結合，又能夠感染宿主菌而進行再擴增，實現相應融合蛋白的擴增，再經過“吸附—洗脫—擴增”過程就能篩選并富集特異性抗體。將B細胞全套可變區基因克隆出來，組成噬菌體抗體的群體，就成為了噬菌體抗體庫[8]，而建立噬菌體抗體庫的全套方法便被稱為噬菌體抗體庫技術。它的最大特點是實現了直接將基因型和表型聯系在一起，可以快速而高效地從大量克隆中篩選出特異性抗體。根據抗體基因的來源和組成不同，噬菌體抗體庫可分為天然抗體庫、免疫抗體庫、半合成抗體庫和轉基因鼠抗體庫。

噬菌體抗體庫技術的產生依賴于三項實驗技術的發展：一是簡并引物的設計成功及從雜交瘤細胞中擴增出全套抗體可變區基因的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增技術的創建；二是從大腸桿菌分泌有結合功能的免疫球蛋白分子片段的成功；三是噬菌體表面展示技術的建立。

應用噬菌體抗體庫技術制備抗體的優勢在于：①方法簡單快速高效，不經過雜交瘤技術和不需復雜的基因工程技術，制備一株抗體僅需幾周時間；②抗體篩選范圍廣，可對百萬至億萬個分子進行選擇；③用不同的抗原進行篩選，可同時獲得幾種不同的抗體。

2 噬菌體抗體庫的構建過程

構建噬菌體抗體庫主要可以分為以下3個步驟：

2.1 擴增全套抗體基因 獲取已經過免疫的人外周血淋巴、脾、扁桃腺、淋巴結組織或骨髓細胞，從中提取總RNA或基因組DNA。理論上每個靜止期B細胞可產生100個拷貝的Ig mRNA，而增殖期的漿細胞可產生300個。因此，免疫接種可明顯提高Ig mRNA和編碼抗原結合部位V區基因的數量。通過逆轉錄PCR(RT-PCR)擴增技術獲得建庫所需的全套抗體基因[9～12]。

抗體基因擴增的5′端引物的設計通常是根據成熟抗體V區外顯子的框架1區(FR1)或前導區的保守序列，而3′端引物的設計則主要依據抗體絞鏈區(J區)的保守序列。根據已有的抗體庫基因序列庫(Kabat database， V-base， IMGT等)，設計簡并引物。分別對抗體 cDNA或DNA擴增后，將擴增產物予以混合。若制備ScFv抗體基因片段，須設計接頭(linkers)DNA，如[Gly4-Ser]3的編碼寡核苷酸，制備VH-linker-VL基因連接物，進行下一步的基因克隆與表達[13，14]。

2.2 構建合適的噬菌體表面展示載體 噬菌體抗體庫技術使用的載體是在已有的噬菌?；A上改建的。這些載體都具備必需的元件, 包括啟動子、大腸桿菌前導序列、核糖體結合部位、供外源基因插入的多克隆位點以及絲狀噬菌體M13的外殼蛋白基因。pcomb3是一個經常用于噬菌體建庫的載體，它除了保留原載體中的前導序列及供外源基因插入的多克隆位點外，還引入來自M13噬菌體LacZ啟動子、操縱子及用于控制輕鏈基因的帽子結合位點等。對其進一步拼接編碼M13噬菌體外殼蛋白的gⅢ基因，并在克隆位點上加入來自于pbluescript的填充片段便構成了4029 bp的pcomb3。使用載體構建抗體基因庫時，可將獲得的全套重鏈和輕鏈基因以適當的內切酶消化后，克隆進載體的相應酶切位點。經過隨機重排組合將這些基因插入到噬菌體或噬菌粒表達載體多克隆位點中。經克隆進入載體的重、輕鏈基因間的配對也存在著很大的隨機性，這可以豐富抗體庫的內涵，增加抗體庫的多樣性。

2.3 將抗體基因庫轉化大腸桿菌備用 在建庫過程中由于PCR擴增，半合成寡核苷酸的引入以及多步酶學反應等因素產生的重復克隆、無效克隆及克隆數丟失，使庫容量偏小。因此，噬菌體抗體庫的大小與大腸桿菌轉化率明顯相關。通過優化實驗條件，提高限制性內切酶的酶切與連接效率；選擇合適的載體與目的基因的比例；選用轉化效率高的感受態細胞，能提高單次連接和轉化的效率。再通過增加連接與轉化的次數，就能使400 μL感受態的大腸桿菌經電穿孔轉化，至少有108個細胞可被噬菌粒載體轉染。這與體內抗體庫獨特型數目一致。如果噬菌粒在體外包裝后則還可以明顯增加轉染大腸桿菌的數量。因此，電穿孔是一種理想而有效的增加大腸桿菌抗體庫數量的手段。

3 噬菌體抗體庫的篩選

噬菌體抗體庫的篩選包括淘篩和鑒定。淘篩(panning)是指噬菌體抗體庫與選擇的抗原共同孵育，通過幾輪洗脫中斷噬菌體-抗原反應(不影響噬菌體的感染能力)，棄去未結合的噬菌體，收集結合的噬菌體。具體的步驟：①噬菌體吸附靶抗原；②反復洗滌去除非特異性結合；③洗脫并收集與抗原結合的噬菌體；④再次感染大腸桿菌，使特異的噬菌體抗體淘篩。經過一輪這樣的“吸附—洗脫—擴增”的淘篩，可使特異性抗體的噬菌體富集20～1000倍。若每一輪淘篩按50倍的富集率計算，經過4輪淘篩，可使噬菌體抗體的富集率達108以上，篩選出占庫容量僅為1/108的噬菌體抗體，噬菌體抗體庫技術借助這種高效篩選系統，能夠方便地對庫容量在108以上的抗體進行篩選。這種極強的篩選能力是早期的抗體庫技術所望塵莫及的[15～17]。

目前，已經根據篩選的不同要求發展出了多種篩選方法，包括：固相淘篩(將抗原固定于免疫管或制成親和柱進行免疫淘選)、捕獲淘篩(將靶抗原特異的單抗或多抗固定于固相表面，隨后加入靶抗原進行淘選)、完整細胞淘篩(用完整細胞對抗體庫進行淘選)、組織淘篩和器官淘篩等。這些方法均有成功的報道，為噬菌體抗體的淘篩增添了新的途徑。

要獲得高親和力的噬菌體抗體，抗體庫的篩選是關鍵環節。在篩選過程中，噬菌體種類、固相介質表面的抗原密度或溶液中抗原的濃度和清洗時間三種因素對篩選的效率影響較大。當篩選較小的抗體庫(107～108克隆)時，在前幾輪采用中等的嚴緊度有利于避免高親和力低表達克隆的丟失，而較大的抗體庫則可采用較高嚴緊度以較快地富集親和性克隆。

4 噬菌體抗體庫技術的應用

近年來，噬菌體抗體庫已成為基因工程抗體研究的熱點之一，并被廣泛應用于生命科學的各個領域。利用噬菌體抗體庫技術已經獲得了大量針對病原微生物的抗體，如甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、風疹病毒、流感嗜血桿菌、破傷風毒素以及嚴重急性呼吸綜合癥(SARS)病毒等[18～21]。這些噬菌體抗體中，許多具有臨床診斷和治療的應用前景。以抗體庫技術為工具，了解機體受病原微生物感染時所激發的體液免疫反應格局，為疫苗設計和發病機制的研究提供依據。

來源于病人的噬菌體抗體，在基因結構和生物學性質上真實地反映機體的免疫狀態。利用這類單抗可以分析自身抗原的表位結構；以人自身抗體為探針分析自身免疫疾病患者血清中自身抗體的“表位指紋”，有助于了解B細胞表位和疾病表現之間的關系。通過分析自身抗體可變區的編碼基因，能夠了解此類抗體的基因取用規律。利用腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原篩選噬菌體抗體庫，能夠得到特異性人單抗。將其接在腫瘤壞死因子和其他淋巴因子上，用于腫瘤的免疫治療，增強抗腫瘤活性；而將其接上同位素則可用于腫瘤顯像分析[22]。

噬菌體抗體庫技術與單抗技術相比，其優勢在于能夠制備人單抗，從而避免了鼠單抗應用于人體時而引發的免疫反應。而且，通過體外親和力成熟技術和動力學常數篩選技術，能夠對有關抗體進行改造，從中得到特異性和動力學特性均較好的抗體。

5 結語

噬菌體抗體庫技術是抗體工程發展進程的一個里程碑。經過不斷努力，目前噬菌體抗體庫技術已經比較成熟，并已經在世界范圍內推廣和應用，在分子生物學、免疫學和醫學等領域產生了廣泛的影響。

但是此技術目前還有許多問題尚待解決。例如，如何實現抗體的全分子表達，如何獲得庫容量大、特異性高、敏感性強的抗體庫以及如何提高抗體的產量等?？梢韵嘈?，隨著各種優化方法的建立，噬菌體抗體庫技術將為治愈某些嚴重危害人類健康的疾病帶來希望。