云南松花粉儲藏溫度及離體萌發條件

李 梅，周蘭英

（四川農業大學 林學院，四川 成都611130）

云南松花粉儲藏溫度及離體萌發條件

李 梅，周蘭英

（四川農業大學 林學院，四川 成都611130）

以云南松Pinus yunnanesis花粉為材料，通過設置3種儲藏溫度（25℃，5℃，-20℃）探討花粉生活力隨時間的變化規律；通過單因子實驗和正交實驗，探究不同質量濃度的蔗糖、硼酸、赤霉素、氯化鈣單獨或共同作用對花粉萌發的影響。結果表明：云南松花粉儲藏0 d時花粉生活力為91.77%，隨著儲藏時間的增加3種儲藏溫度的花粉生活力均下降，下降速率表現為25℃＞5℃＞-20℃，說明低溫能增加花粉的耐儲性。單因子萌發實驗顯示：蔗糖的最適質量濃度為80 g·L－1，萌發率為82.41%；赤霉素的最適質量濃度為100 mg·L－1，萌發率為66.41%；硼酸的最適質量濃度為300 mg·L－1，萌發率為18.23%；氯化鈣的最適質量濃度為100 mg·L－1，萌發率為56.98%。正交實驗顯示：4種因素的最佳組合為120 g·L－1蔗糖+150 mg·L－1赤霉素+100 mg·L－1氯化鈣+100 mg·L－1硼酸，萌發率可達89.74%。圖3表2參11

林木育種學；云南松；花粉；儲藏溫度；生活力；萌發

云南松Pinus yunnanesis是松科Pinaceae松屬Pinus常綠針葉喬木，生長快，材質好，耐干旱瘠薄，天然更新能力強，是西南地區荒山造林先鋒樹種和主要的用材樹種［1］，具有很高的經濟開發價值。然而，因遺傳改良滯后，云南松優質高效人工林的發展受到嚴重制約。有研究［2］表明，云南松樹高、通直度、結實量等性狀受基因連鎖或功效基因的作用較大，受環境的影響較小，有較高的遺傳穩定性。同時，群體內存在許多生長、形質和材性兼優的家系、個體，尤其是生長性狀的遺傳變異潛力巨大，只要通過有效的良種選育就能發掘這些優良基因型［3］。花粉研究是研究遺傳改良的重要內容，對于云南松花粉，除了花粉形態［4］、花粉成分［5］研究外，尚未見有關花粉生活力方面的研究報道。本研究通過對云南松花粉儲藏溫度及萌發條件的探究，旨在為云南松雜交育種工作的順利開展提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料

云南松花粉采自四川省會理縣太平鎮云南松人工林。

1.2 方法

1.2.1 花粉收集 2014年4月下旬采集成熟的云南松雄球花，置于光滑紙面上，在室內攤晾收集，花粉混合均勻后裝入牛皮紙袋中帶回實驗室。

1.2.2 儲藏溫度和儲藏時間對云南松花粉生活力的影響 將花粉分裝在清潔干燥帶瓶蓋的青霉素小瓶中，標記，分別置于25℃，5℃，－20℃條件下儲藏。儲藏初期隔24 h測定3種儲藏溫度下花粉的生活力，后期可根據情況延長測定間隔時間，直到花粉失去生活力（花粉生活力低于50%）。

1.2.3 花粉生活力測定 采用碘-碘化鉀染色法、α-萘酚-聯苯胺法、次甲基藍染色法等3種方法測定花粉生活力，篩選出能快速準確測定花粉生活力的方法。測定時，先將低溫條件下的云南松花粉在常溫下放置0.5 h，再用染色劑處理，重復3個·處理－1，觀察清晰視野5個·重復-1，統計花粉粒數≥30粒·視野-1，統計各視野花粉生活力，并計算各處理平均生活力。花粉生活力（%）=（染色花粉數/統計花粉總數）×100%。

1.2.4 花粉萌發條件的測定 設置培養液蔗糖質量濃度為0，50，80，100，120 g·L-1；硼酸質量濃度為0，100，300，500 mg·L－1； 赤霉素質量濃度為 0，50， 100，150 mg·L－1； 氯化鈣質量濃度為0，50，100，150 mg·L－1。通過單因素實驗，篩選出培養液各因素的最適質量濃度，再進行正交實驗設計，篩選出培養液各因素最佳質量濃度組合。花粉采用液體培養法進行培養，先將解剖針和雙凹片干燥滅菌，處理時用解剖針蘸取少量花粉散播在載有不同培養液的雙凹片凹孔中，蓋上蓋玻片，置于25℃LHP-300H智能型人工氣候箱中黑暗培養。3 h在顯微鏡下觀測1次，重復3次·處理－1，觀察清晰視野5個·重復-1，統計花粉粒數≥30粒·視野-1，當花粉管長度≥花粉直徑時視為花粉萌發，觀察至萌發率不再增加為止。統計各視野花粉生活力，并計算各處理平均生活力。花粉萌發率（%）=（花粉萌發數/統計花粉總數）×100%。

1.2.5 數據處理 所得數據用Excel，SPSS 20進行統計分析。進行方差分析時，需對原始數據進行反正弦轉換。

2 結果與分析

2.1 不同儲藏溫度和儲藏時間下花粉生活力變化的比較

a-萘酚-聯苯胺法染色不明顯，次甲基藍染色法在進行染色梯度界定時無固定標準，難統一，而經碘-碘化鉀染色法測定結果穩定、易辨別、最接近萌發實驗結果，因此，本研究以碘-碘化鉀染色法測定結果作為論述依據。測定結果（圖1）顯示：隨著儲藏天數的增加，3種儲藏溫度下云南松花粉生活力均下降，但儲藏溫度不同，花粉生活力下降的速率不同，其中25℃條件下花粉生活力下降較快，5℃條件和－20℃條件下花粉生活力下降趨勢都較為平緩，總的花粉生活力下降趨勢表現為25℃＞5℃＞－20℃。方差分析結果表明：儲藏時間和儲藏溫度對花粉生活力的影響達極顯著水平（F儲藏時間=35.482＞F0.01；F儲藏溫度= 30.404＞F0.01），且儲藏溫度的F值較儲藏時間的F值大，說明儲藏溫度比儲藏時間對花粉生活力的影響大。多重比較顯示（表1）：3種儲藏溫度對云南松花粉生活力影響顯著，均數大小表現為－20℃＞5℃＞25℃，即表明－20℃條件對花粉生活力的保持顯著優于5℃條件和25℃條件，5℃條件顯著優于25℃條件。

圖1 不同儲藏溫度下花粉生活力的比較Figure 1 Comparison ofpollen viability under different storage conditions

2.2 花粉萌發

2.2.1 花粉萌發時間和過程 云南松花粉萌發過程見圖2。云南松花粉在培養24 h之前不萌發，培養24~72 h，萌發率急劇上升，72 h后萌發率趨于平穩，超過72 h以后新增花粉萌發數極少，可見，72 h后即可統計花粉萌發率。花粉粒萌動時萌發溝薄壁區呈透明狀態并向兩邊突起，繼而其中一端或兩端伸長成為花粉管，花粉管生長后期會分支，甚至破裂。

表1 均衡子集表Table 1 Balanced subsets table

圖2 云南松花粉萌發過程Figure 2 Mination process of Pinus yunnanesis pollen

2.2.2 蔗糖、氯化鈣、硼酸、赤霉素單因子作用對云南松花粉萌發的影響 由圖3A可知：蔗糖對云南松花粉萌發存在極顯著影響。花粉在清水中也能萌發，平均萌發率為9.02%，隨著蔗糖質量濃度的增加，花粉萌發率呈先升高后降低的趨勢，在蔗糖質量濃度為80 g·L-1時最高，為82.41%。蔗糖質量濃度超過80 g·L-1后花粉萌發率降低，可見最適蔗糖質量濃度為80 g·L-1。由圖3B可知：不同質量濃度的氯化鈣對云南松花粉萌發率影響程度不同。當培養基氯化鈣質量濃度為 50 mg·L-1時，萌發率為13.06%；隨氯化鈣質量濃度的增加花粉萌發率逐漸升高，當氯化鈣質量濃度升至100 mg·L-1時，萌發率達到最高，為56.98%；但隨著氯化鈣質量濃度繼續增加，花粉萌發率下降。可見云南松花粉萌發的適宜氯化鈣質量濃度是100 mg·L-1。由圖3C可知：硼酸質量濃度為300 mg·L-1時，花粉萌發率達到最大值18.23%，極顯著高于對照和100 mg·L-1；而質量濃度為500 mg·L-1時，花粉萌發受到強烈抑制，萌發率僅為1.35%，極顯著低于清水處理。結果表明：云南松花粉萌發的較適宜硼酸質量濃度為300 mg· L-1。由圖3D可知：當培養基赤霉素質量濃度為100 mg·L-1時，花粉萌發率達到最大值66.41%，極顯著高于其他處理。蔗糖、氯化鈣、硼酸、赤霉素等單因子對云南松花粉的萌發都存在極顯著影響，添加后大部分萌發率比對照有顯著增長，以蔗糖作用最明顯。單因子實驗結果顯示最適濃度組合為80 g·L-1蔗糖+100 mg·L-1赤霉素+100 mg·L-1氯化鈣+300 mg·L-1硼酸。

圖3 蔗糖、氯化鈣、硼酸、赤霉素對云南松花粉萌發的影響Figure 3 Effect of sucrose,CaCl2,H3BO3and GA3on in vitro pollen germinetion of Pinus yunnanesis

2.2.3 蔗糖、氯化鈣、硼酸、赤霉素等4因子正交實驗對云南松花粉萌發率的影響 表2結果表明：蔗糖、硼酸、赤霉素、氯化鈣在一定質量濃度范圍內共同作用能明顯提高云南松花粉的萌發率。實驗中各組處理對花粉萌發率的影響與對照組都存在極顯著差異，其中處理1萌發率最高，達89.74%；其次為處理2，達77.65%。正交實驗結果顯示最優搭配為120 g·L-1蔗糖+150 mg·L－1赤霉素+100 mg·L－1氯化鈣+100 mg·L－1硼酸，與單因子實驗所得結果有差異，這說明各種營養因子對花粉萌發的影響是相互作用的。

表2 花粉萌發L9（34）正交實驗結果Table 2 Pollen germination rate in orthogonal design experiment

3 結論與討論

3.1 花粉生活力

研究表明：碘-碘化鉀染色法能反應不同儲藏溫度下花粉生活力的變化趨勢。染色法測定的花粉生活力略高于培養基法，這是因為染色時染色劑也能對未成熟、衰老和敗育的花粉進行染色，而這類花粉不一定都具有受精能力，以致測定結果往往偏高。雖然培養基法是最能準確測定花粉生活力的方法，但是其耗時長，操作過程相對復雜，碘-碘化鉀染色法能快速準確地測定云南松花粉的生活力。

報道顯示［6-8］：銀杉Cathaya argyrophylla等裸子植物的鮮花粉生活力均在90%以上。本研究通過碘-碘化鉀染色法測定云南松鮮花粉的生活力為91.77%，與以上裸子植物結果相一致，都具有較高的鮮花粉生活力。本研究還表明：云南松花粉具有較高的耐儲藏性，在25℃條件下儲藏463 d時云南松花粉生活力為48.21%，在5℃條件下儲藏463 d時為60.28%，在－20℃條件下463 d時為72.34%。儲藏時間和儲藏溫度對于花粉生活力都有極顯著的影響，但儲藏溫度影響更大。這是因為低溫能降低花粉呼吸強度，減少自身營養物質的消耗。

3.2 花粉萌發條件

蔗糖是許多植物花粉離體培養所必需的營養成分，一般認為蔗糖為花粉的萌發和花粉管的生長提供了能源和碳源，同時還能調節培養環境滲透壓。蔗糖適宜質量濃度通常為100~150 g·L-1，云南松花粉萌發的最適宜蔗糖質量濃度為80 g·L-1，且總體情況是低質量濃度比高質量濃度對花粉萌發更有利。其原因可能是高質量濃度蔗糖造成花粉細胞質壁分離，使花粉粒脫水，從而影響花粉的萌發。鈣離子是花粉管生長的基本因素。本研究中單因子氯化鈣質量濃度對花粉萌發的影響極顯著，低質量濃度時對花粉萌發率的影響不大，質量濃度增加能顯著提高花粉萌發率，100 mg·L－1時萌發率達最大值56.98%。可能云南松花粉自身含有較少的鈣離子，萌發時外源鈣離子的適量補充可以促進其萌發。硼不僅可以增加糖的吸收、運轉和代謝，形成花粉管頂端生長依賴的梯度，還可能作為一種相關因子影響關鍵酶活性，改變細胞壁延展性以至影響花粉的萌發、花粉管細胞壁的構建和花粉管的伸長［9］。一般認為，花粉內存在較多的鈣，而缺乏硼，因硼的缺乏往往要從柱頭和花柱內獲得硼的補償［10］。本研究中，云南松花粉萌發對硼需要量十分微小，在最適質量濃度300 mg·L－1時萌發率僅為18.23%，500 mg·L－1時即表現為強烈的抑制作用，可能花粉內含有較多的硼元素，能在一定程度上滿足花粉萌發所需，但硼適量的補充也能提高花粉萌發率。雖然目前有關赤霉素等植物生長調節物質能促進花粉的萌發和花粉管生長的機制尚不清楚，但已有研究表明花粉自身富含生長素及赤霉素等生長調節物質，這些物質的多少對花粉自身的萌發、生長及儲藏壽命均有較大的影響，對花粉管在花柱內生長完成受精及促進果實膨大也有重要的作用，因此，一定質量濃度的外源赤霉素處理能促進花粉萌發和花粉管生長［11］。在本研究中赤霉素對花粉萌發率存在極顯著性影響，以100 mg·L－1最佳，萌發率可達66.41%。總體來說，云南松花粉生活力強，對培養基營養物質的需求量不高，單因子以蔗糖作用最明顯，正交實驗最適的液體培養基組合為120 g· L-1+150 mg·L－1赤霉素+100 mg·L－1氯化鈣+100 mg·L－1硼酸。這可能是因為云南松花粉中自身含有的能量物質較多，適量補充能更好地滿足萌發所需營養物質，高質量濃度的營養物質補充反而會抑制花粉的正常萌發。

在雜交授粉實際操作中，一般采用生活力不低于新鮮花粉生活力的50%的花粉進行授粉，因此，云南松花粉在25℃條件下儲藏1 a之內可用于授粉，低溫儲藏能有效延緩花粉生活力下降的速度。在授粉時可以噴施一定質量濃度的蔗糖、赤霉素，促進花粉萌發和花粉管伸長，進而提高雜交育種成效。

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Storage temperature and pollen viability of Pinus yunnanensis

LI Mei,ZHOU Lanying
（College of Forestry,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,Sichuan,China）

To determine the storage temperature and pollen viability of Pinus yunnanensis,different storage conditions of 25℃,5℃,and－20℃ were used to study variation in pollen viability.Different treatments of sucrose,H3BO3,GA3,and CaCl2were used to determine the effects on pollen germination.Analysis employed orthogonal experiments alone as well as interactions.Results showed that pollen viability was 91.8%at 0 d and then decreased with greater storage time at temperatures of 25℃＞5℃＞－20℃.Germination tests showed that the optimal concentration and the corresponding germination rate were as follows:sucrose-80 g·L－1and 82.4%,GA3-100 mg·L－1and 66.4%,H3BO3-300 mg·L－1and 18.2%,and CaCl2-100 mg·L－1and 57.0%.The best combination of four factors was 120 g·L－1sucrose+150 mg·L－1GA3+100 mg·L－1H3BO3+100 mg·L－1CaCl2with a pollen germination rate of 89.7%.Meanwhile,above a certain concentration of the culture medium had inhibitory effects on pollen germination.Thus,low temperatures increased pollen storage time.［Ch,3 fig. 2 tab.11 ref.］

forest tree breeding;Pinus yunnanensis;pollen;storage temperature;viability;germination

S722.3；Q944.42

A

2095-0756（2017）01-0063-05

2016-01-07；

2016-03-31

四川省科學技術攻關項目（2011NZ0098-10）

李梅，從事園林植物與觀賞園藝研究。E-mail：limei862@sina.com。通信作者：周蘭英，教授，博士，從事林木遺傳育種研究。E-mail：kelin1234@sina.com

浙 江 農 林 大 學 學 報，2017，34（1）：68-77

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.011