氣體信號分子H2S對擬南芥生長發育的影響

岳斌，裴雁曦，劉旦梅，劉志強

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

氣體信號分子H2S對擬南芥生長發育的影響

岳斌，裴雁曦，劉旦梅，劉志強

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

硫化氫（H2S）是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第3種氣體信號分子。對于H2S調節植物脅迫響應的研究已經有大量的報道，而H2S在植物發育過程中的影響還有待研究。以NaHS作為外源H2S供體，觀察其對野生型擬南芥生長發育的影響。結果表明，H2S可延緩擬南芥抽薹，提高葉綠素含量、凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（T）、氣孔導度（G），降低細胞間隙CO2濃度（C）。實時熒光定量PCR和半定量PCR結果表明，H2S可提高擬南芥光合作用相關基因Rubicso，RCA，LHCB3，LHCB2，GPD的表達量。外源生理濃度H2S可提高擬南芥光合性能，延緩抽薹時間。

硫化氫；擬南芥；光合作用

硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）氣體無色有臭雞蛋氣味，分子量小可以自由穿過細胞膜，其身份已經從早期的毒性氣體轉變為氣體信號分子。H2S自1996年經ABE等[1]首次證明作為一種神經活性物質存在于人體，其生理調節作用逐漸為人們所重視。2001年，ZHAO等[2]測定H2S在動物血管組織中的含量約為（45.6±14.2）μmol/L，并發現其具有調節K+-ATP通道的功能。YANG等[3]在《Science》發表論文，證明H2S可在動物體內內源產生，可以調節血管舒張。近來研究發現，H2S可促進人體角質細胞的增殖和分化[4]。

H2S在植物體內同樣可內源產生[5-7]，可有效緩解逆境及重金屬等對植物造成的傷害[8-10]。在菠菜儲存過程中，H2S可提高其抗氧化能力[11]。在香蕉冷藏過程中，H2S可降低MDA含量，增強其能量代謝過程中H+-ATPase，Ca2+-ATPase，琥珀酸脫氫酶和細胞色素C氧化酶的活力[12]。2016年，裴雁曦[13]對H2S在植物體的信號分子功能進行了較為詳細的介紹。

綠色植物通過光合作用同化CO2和H2O，制造有機物并釋放O2，這是植物自身生長發育，也是整個生物界賴以生存的基礎。在植物的生長發育過程中，光合作用效率是植物生產力和作物產量高低的根本決定因素[14]。研究表明，楊樹的苗木生長量，特別是苗高與凈光合作用速率聯系密切[15]。植物的光合能力受自身葉片結構特征與生化組成，以及外界環境因素的影響[16-17]；紅藍比3∶1的LED光源補光處理可顯著提高草莓葉綠素a的含量[18]；在干旱脅迫下沙棘葉片可通過增加天線色素的熱耗散，增強抗氧化酶活性，穩定光合作用系統的功能[19]；干旱脅迫會使小麥和糜子的凈光合速率降低[20-21]；小麥揚花期和灌漿期的光合速率隨著水分的減少而呈降低趨勢[22]；寧夏枸杞葉片的凈光合作用速率隨氣溫升高而降低[23]。

H2S作為氣體信號分子，可增強植物生物和非生物抗逆性。本研究以NaHS作為外源H2S供體，觀察其對野生型擬南芥生長發育的影響，旨在為H2S調節植物生理功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料培養及處理

試驗材料為野生型擬南芥（Col-0）。種子春化后播種在等體積土與蛭石組成的混合基質中，培養條件為溫度23℃，相對濕度60%，光照強度3 000 lx，光周期16/8 h（晝/夜），長出真葉后進行處理。NaHS處理濃度分別為50，100μmo/L（每天熏蒸6h）。不施加NaHS的野生型擬南芥為對照組（CK）。

1.2 表型及生理指標的測定

以NaHS作為外源H2S供體處理擬南芥，每3 d對植株的葉長、葉寬、葉片數目及株高測量一次，并進行數據統計。

對處理17，24，31 d的植株進行葉片氣體交換參數和葉綠素含量的測定。凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（E）、氣孔導度（Gs）、細胞間隙CO2濃度（C）使用CB-1102便攜式光合蒸騰儀（北京雅欣理儀科技有限公司）進行檢測，測定時需光源充足且穩定，空氣中CO2含量穩定。

葉綠素含量測定：取新鮮植物葉片樣品0.1 g，放入研缽中，加少量石英砂及2 mL 95%乙醇，研成勻漿，3000r/min，離心1min。取上清稀釋至20mL。利用紫外分光光度計測665，649 nm處的吸光值，分別以A665和A649表示。

其中，Ca為葉綠素a的濃度，Cb為葉素素b的濃度，CT為葉綠素總濃度。

所測葉片的葉綠素含量計算公式如下。

其中，V為提取液總量（mL），W為樣品質量（g）。

1.3 基因表達檢測

擬南芥幼苗總RNA提取及基因表達檢測參考Jin等[24]的方法，分別用半定量PCR和qRT-PCR檢測光合基因表達量（引物如表1所示），以UBQ為內參，qRT-PCR數據采集與分析使用IQ5軟件。

表1 引物

1.4 統計分析

數據使用SPSS13軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 H2S對擬南芥表型的影響

葉片是綠色植物進行光合作用的主要器官，統計數據表明，H2S處理過的擬南芥與對照組相比，在葉片的長度（圖1-A）、寬度（圖1-B）和葉片數目（圖1-C）上沒有顯著變化。觀察發現，H2S處理延緩了擬南芥的抽薹時間，造成植株高度差異（圖1-D），但H2S對抽薹后的植株高度沒有顯著影響。

2.2 H2S對擬南芥光合作用效率的影響

光合作用是自然界碳-氧平衡的重要媒介，是植物補充營養物質的重要過程。凈光合速率是凈光合作用產生糖類的速率。蒸騰速率能反映植物在一定時間內單位葉面積蒸騰的水量。氣孔導度對蒸騰速率有著直接的影響。胞間CO2濃度受到氣孔導度、葉肉細胞光合活性的影響。分別測定H2S處理17，24，31 d的擬南芥及對照組的4種光合效率指標。與對照組相比，處理24，31 d的擬南芥凈光合作用速率升高（圖2-A）。施加H2S處理17，31 d的擬南芥蒸騰速率（圖2-B）、葉片氣孔導度（圖2-C）均顯著高于對照組。施加H2S處理17，31 d的胞間CO2濃度（圖2-D）顯著低于對照組。

2.3 H2S對擬南芥葉綠素含量的影響

葉片內的色素可調節光能的捕獲和傳遞。葉綠素是光合作用的基礎，擬南芥光合效率的變化與葉綠素含量變化聯系緊密。H2S處理24 d的擬南芥葉綠素含量顯著高于對照組（圖3）。

2.4 H2S對擬南芥光合基因表達量的影響

光合性能的調節與光合基因的表達量息息相關。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（ribulose-bisphosphate carboxylase/oxygenase，Rubicso），核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶激活酶（rubicsoactivase，RCA）和光合系統Ⅱ葉綠素結合蛋白LHCB3，LHCB2及NADP依賴的三磷酸甘油醛脫氫酶（NADP-dependentglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GPD）作為光系統結構相關蛋白對植物光合碳同化起重要作用。Rubicso是光合作用C3反應中重要的羧化酶，也是光呼吸中不可缺少的加氧酶。鈍化態Rubisco必須經過RCA的活化才能表現出其羧化/加氧活性。光合系統Ⅱ葉綠素結合蛋白可吸收光能及傳遞光能到作用中心。三磷酸甘油醛脫氫酶催化3-磷酸甘油醛氧化（脫氫）和磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸，是糖代謝的中心環節。對不同處理的擬南芥植株進行qRT-PCR和半定量PCR檢測。結果表明，施加H2S處理后的擬南芥植株內光合基因Rubicso，RCA，LHCB3，LHCB2和GPD的表達量升高（圖4）。

3 討論與結論

擬南芥發育過程中，葉片長度、寬度、植株所含葉數及高度的變化與其所處的環境息息相關。H2S可以提高銅離子脅迫下小麥種子發芽率以及根長和芽長[25]。在本試驗中，經由H2S處理的擬南芥植株的葉片長度、寬度及葉片數目與對照相比無明顯變化；植株高度低于不施加H2S處理的對照組，即H2S處理的擬南芥植株與對照組相比，抽薹時間得到延緩。幼苗在適宜的生長條件下，由營養生長轉為生殖生長，花芽分化后，花莖迅速發育開始抽薹[26]。當水分、肥料、溫度等環境條件優越時，植株的營養生長占優勢，生殖生長進程就相應推遲[27]。在本試驗中，H2S處理的擬南芥植株光合作用效率高于對照組，獲得更多的營養物質以滿足植物生長的需要，從而使擬南芥在生長過程中偏離了正常的生長周期，抽薹時間得到延緩。

植物對光的吸收能力與光合作用效率密切相關，導致凈光合速率上升的原因主要有氣孔因素和非氣孔因素2種[28]，氣孔因素包括氣孔數量、氣孔孔徑、氣孔開度等，非氣孔因素包括細胞內部酶活性和光合組分等。氣孔是植物葉片與外界進行氣體交換的主要通道。通過氣孔擴散的氣體有O2，CO2。外源H2S處理可通過提高氣孔開度增強水稻的光合作用[29]。H2S供體NaHS能增加菠菜（Spinaciaoleracea）葉片葉綠素含量、可溶性蛋白和生物量，并能改變葉綠體超微結構和提高光合速率[30]。本試驗中，H2S處理后植株的凈光合作用速率、蒸騰速率及葉片氣孔導度得到提高。本試驗中凈光合速率和蒸騰速率的提高表明H2S處理可增強光合速率與蒸騰速率，使得植株合理分配光合產物。在測量過程中發現，H2S處理后擬南芥植株胞間CO2濃度并不總低于對照組，推測葉肉細胞光合性能提高使胞間CO2濃度降低過程中受到外界CO2濃度的影響。

葉綠體是植物細胞特有的細胞器，光合作用主要發生在葉片的葉綠體中，其中，光能的吸收和轉換主要由葉綠素分子完成。持續的常溫弱光會使黃瓜的葉綠素含量降低，生長放緩[31]。本試驗結果表明，經過H2S處理的植株其葉綠素含量得到了提高。推測H2S可通過提高葉綠素含量促進光合效率的提高，為擬南芥的生長提供充足的營養。

H2S處理后的擬南芥植株光合基因Rubicso，RCA，LHCB3，LHCB2和GPD的表達量升高，表明其光合性能的提高是由于光合作用相關基因表達量增多而引起的。

綜上所述，通過外源施加生理濃度的H2S可提高光合基因Rubicso，RCA，LHCB3，LHCB2和GPD的表達量，進而提高擬南芥植株中葉綠素的含量，提高凈光合作用速率、蒸騰速率、葉片氣孔導度等光合指標，延長營養生長的時間，推遲其抽薹。

［1］ABE K，KIMURAH.The possible role ofhydrogen sulfide as an endogenous neuromodulator[J].Neurosci，1996，16：1066-1071.

［2］ZHAOW，ZHANGJ，LUY，et al.The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATP channel opener[J].EmboJournal，2001，20（21）：6008-6016.

［3］YANG G，WU L，JIANG B，et al.H2S as physiologic vasorelaxant: hypertension in mice with deletion of cystathionine γ-Lyase[J].Science，2008，322：587-590.

［4］XIE X，DAI H，ZHUANG B，et al.Exogenous hydrogen sulfide promotes cell proliferation and differentiation by modulating autophagy in human keratinocytes[J].Biochemical&Biophysical Research Communications，2016，472（3）：437-443.

［5］H?LLGRENJ E，FREDRIKSSONSA.Emission ofhydrogen sulfidefrom sulfur dioxid e-fumigated pine trees[J].Plant Physiology，1982，70（2）：456-459.

［6］WILSON L G，FILNER P.Light-dependent emission of hydrogen sulfide fromplants[J].Plant Physiology，1978，61：184-189.

［7］SEKIYAJ，FILNER P.Emission ofhydrogen sulfide byleaftissue in response toL-cysteine[J].Plant Physiology，1982，70：430-436.

［8］CHEN X，CHEN Q，ZHANG X，et al.Hydrogen sulfide mediates nicotine biosynthesis in tobacco（Nicotiana tabacum）under high temperature conditions[J].Plant Physiology and Biochemistry，2016，104：174-179.

［9］CHEN J，WANG W H，WU F H，et al.Hydrogen sulfide alleviates aluminum toxicity in barley seedlings[J].Plant Soil，2013，362：301-318.

［10］BHARWANA S A，ALI S，FAEOOQ M A，et al.Hydrogen sulfide ameliorates lead-induced morphological，photosynthetic，oxidative damages and biochemical changes in cotton[J].Environ Scipollut Res，2014，21：717-731.

［11］HU H，LIU D，LI P，et al.Hydrogen sulfide delays leaf yellowing of stored water spinach（Ipomoea aquatica）during dark-induced senescence by delaying chlorophyll breakdown，maintaining energy status and increasingantioxidative capacity[J].Postharvest Biology and Technology，2015，108：8-20.

［12］LI D，LIMWACHIRANON J，LI L，et al.Involvement of energy metabolism to chilling tolerance induced by hydrogen sulfide in cold-stored banana fruit[J].Food Chemistry，2016，208：272-278.

［13］裴雁曦.植物中的氣體信號分子硫化氫：無香而立，其臭如蘭[J].中國生物化學與分子生物學報，2016，32（7）：721-733.

［14］許大全.光合作用效率[M].上海：上海科學技術出版社，2002.

［15］劉巍，茼勝軍，張妍.不同種類楊樹品種光合特性及生長性狀的研究[J].遼寧林業科技，2015（5）：23-28.

［16］GARRAWAYMO，AKHTAR M，WOKOMAE CW.Effect ofhigh temperature stress on peroxidase activity and electrolyte leakage in maize in relation to sporulation of Bipolaris maydis race[J].Phytopathology，1989，79（7）：800-805.

［17］IAN J WEIGHT，PETER B REICH，MARK WESTOBY，et al.The worldwideleafeconomicsspectrum[J].Nature，2004，428：821-827.

［18］陽圣瑩，白勝，蔣浩宏.不同補光處理對設施草莓光合特性及果實品質的影響[J].山西農業科學，2016，44（9）：1298-1303.

［19］PEI B，ZHANG G G，ZHANG S Y，et al.Effects of soil drought stress on photosynthetic characteristics and antioxidant enzyme activities in Hippophae rhamnoides Linn seedings[J].Acta Ecologica Sinica，2013，33（5）：1386-1396.

［20］袁蕊，李萍，孫敏.干旱脅迫對小麥生理特性及產量的影響[J].山西農業科學，2016，44（10）：1446-1449.

［21］劉紫娟，李萍，宗毓錚.干旱脅迫對糜子生理及產量的影響[J].山西農業科學，2016，44（9）：1279-1283.

［22］鄭愛泉.不同水分處理對冬小麥光合生理的影響[J].安徽農業科學，2014，42（19）：6143-6144.

［23］ZHAOQ，CAOB，SONGL H，et al.Effects of elevated temperature and drought stress on photosynthesis of Lycium barbarum[J].Acta Ecologica Sinica，2015，35（18）：6016-6022.

［24］JIN Z P，SHEN J J，QIAO Z J，el al.Hydrogen sulfide improves drought resistance in Arabidopsis thaliana[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2011，414（3）：481-486.

［25］ZHANG H，HU L Y，HU K D，et al.Hydrogen sulfide promotes wheat seed germination and alleviates oxidative damage against copper stress[J].Journal of Integrative Plant Biology，2008，50：1518-1529.

［26］肖艷宏.興城市大寨鄉夏茬大根蘿卜俏頭青未熟抽薹原因分析與預防措施[J].農業與技術，2012，32（8）：114.

［27］鐘龍.當歸過早抽薹的原因[J].農村實用技術，2006（3）：27.

［28］王麗燕，趙可夫.NaCl脅迫對海蓬子（Salicornia bigelovii Torr.）離子區室化、光合作用和生長的影響[J].植物生理與分子生物學學報，2004，30（1）：94-98.

［29］DUANB，MAY，JIANGM，et al.Improvement ofphotosynthesis in rice（Oryza sativa L.）as a result of an increase in stomatal aperture and densitybyexogenous hydrogen sulfide treatment[J].Plant Growth Regul，2015，75：33-44.

［30］CHEN H，WU F H，WANG W H.et al.Hydrogen sulfide enhances photosynthesis through promotingchloroplast biogenesis，photosynthetic enzyme expression，and thiol redox modification in Spinacia oleracea seedlings[J].Journal of Experimental Botany，2011，62（13）：4481-4493.

［31］周艷虹，黃黎鋒，喻景權.持續低溫弱光對黃瓜葉片氣體交換、葉綠素熒光猝滅和吸收光能分配的影響[J].植物生理與分子生物學學報，2004，30（2）：153-160.

Hydrogen Sulfide as a Signal Molecules Influence the Growth and Development inArabidopsis thaliana

YUE Bin，PEI Yanxi，LIUDanmei，LIUZhiqiang
（College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Hydrogen sulfide（H2S）is regarded as the third gasotransmitter after nitric oxide and carbon monoxide.A large number of studies have been reported that H2S can regulate the processes in plants responding to stresses.However,the effects of H2S on plant development need to be further studied.In this study,the seedlings of Arabidopsis were treated with physiological concentrations of H2S which were reported previously and we found that H2S could prolong the time of bolting in Arabidopsis.Leaf chlorophyll content,net photosynthetic rate（Pn）,transpiration rate（T）and stomatal conductance（G）were improved with exogenous H2S treatments.Intercellular space CO2concentration（C）was decreased with the same treatments.The related-gene expressions ofphotosynthesis such as Rubicso，RCA,LHCB3,LHCB2 and GPD were up-regulated treated with exogenous H2S.In conclusion,treatments with physiological concentrations ofexogenous H2Scould enhance the photosynthetic abilities and decrease the boltingtime in Arabidopsis.

hydrogen sulfide;Arabidopsis thaliana;photosynthesis

Q945

A

1002-2481（2017）02-0178-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.07

2016-09-13

國家自然科學青年基金項目（31300236，31501772）；山西省自然科學青年基金項目（2014021026-1）

岳斌（1992-），男，山西運城人，在讀碩士，研究方向：植物生理。劉志強為通信作者。