HPLC法同時測定血府逐瘀水蜜丸中3個易熱解成分的含量

上官同強??+韓風雨??于秀玲???┢肫姜?李洪澤

【摘要】目的：[JP2]建立高效液相色譜法（HPLC）測定血府逐瘀水蜜丸中梓醇、羥基紅花黃色素A、藁本內酯三種指標成分含量的方法。方法：采用DIKMA Diamonsil C18色譜柱（250㎜×46㎜，5μm），流動相為流動相A（甲醇 ∶[KG-*2]乙腈=80 ∶[KG-*2]20），流動相B：05%磷酸水溶液，體積流量10mL/min，梯度洗脫0～8min，98%B；8～20min，98%→75%B；20～21min，75%→40%B；21～40min，40%B；分段波長檢測：0～8min為210nm、8～25min為 403nm、25～40min為280nm，柱溫30℃，進樣量10μL。結果：各成分色譜峰之間有良好的分離度，梓醇進樣量在0199～1989μg（r2=09995），羥基紅花黃色素A進樣量在00392～0392μg（r2=09991），藁本內酯進樣量在00204～0204μg（r2=09992）與峰面積呈良好線性關系；平均回收率在9921%～10092%，RSD均小于20%；樣品中平均含量為：梓醇007%、羥基紅花黃色素A 009%、藁本內酯 005%。結論：該檢測方法操作簡便，結果準確可靠，可以真實反映血府逐瘀水蜜丸在干燥過程中的質量變化。[JP]

【關鍵詞】血府逐瘀水蜜丸；高效液相色譜法；梓醇；羥基紅花黃色素A；藁本內酯

【中圖分類號】R9141【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）01-0012-04

Simultaneous Determination of Three Labile Pyrolysis Components in Xuefuzhuyu Water-honeyed Pill by HPLC

Shangguan Tongqiang1HAN Fengyu3YU Xiuling1*QI Ping2LI Hongze2

1.Inner Mongolia Tianqi Han&Mongolia Pharmaceutical Co， Chifeng 024000，China；2.Inner MongoliaInner Mongolia Boao Modern Mongolian-Chinese Medicine Technology Research co， Chifeng 024000，China；3.Inner Mongolia TianqiPharmaceutical industry investment Co， Chifeng 024000，China

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the dete1rmination of catalpol、hydroxysafflor yellow A、ligustilide in Xuefu Zhuyu Water-honeyed PillMethods Three target components were separated byDIKMA Diamonsil C18（2） column （250 mm × 46 mm， 50 μm） with a gradient mobile phase consisting of methanol-acetonitrile （80 ∶[KG-*2]20， A）-05% phosphoric acid （B） （0～80 min， 98% B； 80～200 min， 98%→75% B； 200～210 min，75%→40% B；210～400 min，40% B）at a flow rate of 10 mL/min，and simultaneously quantificated by variable detection wavelength： 0～80 min， 210 nm； 80～250 min， 403 nm； 250～400 min， 280 nmThe column temperature was 30℃and injection volume was 10 μLResults The calibration curve of catalpol、hydroxysafflor yellow A and ligustilide were linear within 0199～1989μg（r2=09995）， 00392～0392μg（r2=09991） and 00204～0204μg （r2=09992）The average recovery rates were 9921%～10092%， RSD was all below 20%The average contents of catalpol、hydroxysafflor yellow A and ligustilide in Xuefu Zhuyu Water-honeyed Pill were 007%， 009% and 0051%Conclusion The method is simple， accurate and reliable for the quality control of Xuefu Zhuyu Water-honeyed Pill

Keywords：Xuefu Zhuyu Water-honeyed Pill； HPLC； Catalpol ；Hydroxysafflor yellow A； Ligustilide

血府逐瘀丸由血府逐瘀湯劑改成，血府逐瘀丸主要由柴胡、當歸、生地、桃仁、紅花、赤芍、麩炒枳殼、桔梗、牛膝、川芎、甘草11味藥組成。是活血化瘀治則的基本方劑之一，具有活血化瘀、理氣止痛的功效，抗炎消腫，調節人體免疫功能，行氣活血化瘀，改善血液循環，促進周圍微循環暢通，解除組織瘀血，缺血、促進滲出物吸收，恢復視力等作用[1]。方中桃仁、紅花活血化瘀，為君藥；赤芍、當歸和川芎能夠增強主藥的功效，為臣藥。

近年來，水蜜丸較大蜜丸具有服用便宜的優勢，在市場中越來越受到人們的認可。現行標準中國藥典2015版標準[2]，只有大蜜丸質量標準，并無水蜜丸的質量標準。而水蜜丸的生產過程中較大蜜丸增加了干燥過程，可能導致制劑中有效成分損失。鑒于此，研究以血府逐瘀水蜜丸濕丸為研究材料，利用常溫晾干，60℃烘干，70℃烘干，80℃烘干四種干燥方式，通過測定羥基紅花黃色素A[3-5]、梓醇[6-7]、藁本內酯[8-9]成分含量，并作出綜合評價，擬篩選出最適合血府逐瘀水蜜丸干燥的方法，為血府逐瘀水蜜丸質量標準制定提供依據。

1儀器與材料

11儀器日本Shimadzu LC-20A高效液相色譜系統（包括SIL-20AC Autosampler自動進樣器，DGU-20A3R Degassing Unit 脫氣單元，LC-20AT Solvent Delivery Unit 溶液輸送單元，CTO-20AC Column Oven柱溫箱，SPD-M20A Photodiode Array Detector高靈敏度二級管陣列檢測器，LabSolutions LC Workstation Ver5 Multi LC-PDA （中文版）數據工作站，CBM-20Alite System Controller 網絡化系統控制器）；MS105DU電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒公司）；BDGC-EH-S-9型電熱烘箱（河南勃達微波裝備股份有限公司），YUJ-16A制丸機（天水華圓制藥設備科技有限責任公司），CHJ-150槽混機（天水華圓制藥設備科技有限責任公司）。

12材料羥基紅花黃色素A（批號：111637-201308）、梓醇（批號：110808-201210）、藁本內酯（批號：111737-201507）均購于中國藥品生物制品檢定所。血府逐瘀藥粉（批號：20160301）、煉蜜（批號：20160311）來源于內蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司。甲醇（批號：876002）、乙腈（批號：876001）為VBS公司產品，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2方法與結果

21血府逐瘀水蜜丸的制備取血府逐瘀藥粉，過120目，加入適量煉蜜及水，合坨，制丸，拋光，選丸，按以下條件進行干燥備用，詳見表1。常溫干燥：取200g濕丸，平鋪篩網上，置于室內通風干燥處陰干，至樣品水分低于80%。加熱烘干：取200g濕丸三份，平鋪篩網上，置于電熱恒溫烘箱中，分別以60℃、70℃、80℃干燥至樣品水分低于80%。

22溶液制備

221對照品溶液的制備取羥基紅花黃色素A、梓醇、藁本內酯對照品適量，精密稱定，分別置于10mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取單個組分對照品溶液，用50%甲醇稀釋制成混合對照品儲備溶液，其中含羥基紅花黃色素A 40μg/mL，梓醇 200μg/mL，藁本內酯20μg/mL ；取混合對照品儲備溶液稀釋2倍作為對照品溶液。

222供試品溶液的制備取本品適量，研細，取10g精密稱定，精密加入50%甲醇10mL，稱重，超聲40min取出，放涼，補足重量，搖勻，濾過取續濾液，即得。

223陰性樣品溶液的制備取除紅花、川芎、當歸、地黃外的各味藥材，按水蜜丸制備方法及供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。

23色譜條件色譜柱DIKMA Diamonsil C18 （46mm×250mm，5μm）；流動相A：甲醇：乙腈=80∶[KG-*3/5]20；流動相B：01%磷酸水溶液，體積流量1mL/min，梯度洗脫0～8min，98%B；8～20min，98%→75%B；20～21min，75%→40%B；21～40min，40%B；分段變波長測定：0～8min為210nm，8～25min為403nm，25～40min為280nm[10-12]；柱溫30℃；進樣量10μL，進樣器溫度4℃。

24方法學考察

241專屬性考察取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按照“23”色譜條件進行測定，結果供試品中各待測成分色譜峰的分離度均大于15，其他雜質峰與陰性溶液對待測成分均無干擾。見圖1。

242線性關系考察精密吸取按“221”項下方法制備的混合對照品儲備液10、20、40、50、60、80mL，分別置于10mL量瓶中，用流動相A定容，搖勻，與儲備液一起作為系列質量濃度的混合對照品溶液。分別吸取上述系列混合對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程：梓醇Y=50275X-47431，r2=09995，線性范圍1989～1989μg；羥基紅花黃色素A Y=73722X+33089，r2=09991，線性范圍392～392μg；藁本內酯Y=126X+15495，r2=09992，線性范圍204～204μg。見圖2。

243精密度考察精密吸取線性關系考察項下中間質量濃度的混合對照品溶液，連續進樣6次，按上述色譜條件注入液相色譜，記錄色譜圖，測定各待測物質峰面積值。結果梓醇、羥基紅花黃色素A、藁本內酯峰面積的RSD分別為074%、148%、133%，表明精密度良好。

244穩定性試驗取同一份供試品溶液，分別與0、2、4、6、8、12h按上述色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定各待測成分峰面積。結果供試品溶液在12h內色譜峰面積無明顯變化，梓醇、羥基紅花黃色素A、藁本內酯的RSD分別為132%、195%、188%，表明供試品溶液在制備后12h內穩定性良好。

245重復性試驗取同一批樣品6份，按“222”項下方法制備供試品溶液，依法測定各物質的量。結果梓醇、羥基紅花黃色素A、藁本內酯的平均質量分數分別為007%、009%、0051%，RSD分別為137%、151%、191%。

246回收率試驗取245項下的樣品6份，每份約10g，精密稱定，分別精密加入對照品溶液適量，按“222”項下方法制備供試品，照上述色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率。結果梓醇、羥基紅花黃色素A、藁本內酯的平均回收率為10044%、9921%、10092%。

25樣品測定取血府逐瘀藥粉，過120目，加入適量煉蜜及水，合坨，制丸。分別置于80℃、70℃、60℃、常溫條件下干燥。按“222”項下方法制備供試品，照上述色譜條件注入液相色譜，記錄色譜圖，與常溫條件下樣品比較，計算相對含量。結果見表2。

3討論

地黃中梓醇的檢測波長為210nm，紅花中羥基紅花黃色素A檢測波長為403nm，川芎和當歸中的藁本內酯的檢測波長為280nm，各成分之間紫外吸收情況差異較大，為提高分析方法的靈敏度，采用單標檢測確定各成分保留時間，采用分時段波長對三種成分進行測定，最終各成分均在各自最大吸收波長處分別檢測，響應信號好，其他成分干擾小，提高了方法的專屬性。

實驗中的三種成分熱穩定性均不好，選用超聲提取。且血府逐瘀水蜜丸化學成分非常復雜，各成分極性不一致，實驗分別考察了甲醇、乙腈與水相不同比例的提取效果，以及超聲時間對測定結果的影響，結果發現甲醇：05%磷酸水溶液=1∶1，超聲40min時，三種成分組分提取基本完全。故本實驗的提取方法為以甲醇：05%磷酸水溶液=1∶1為溶劑，超聲40min。對3種指標成分進行HPLC分析時，對流動相系統組成比例進行篩選，比較了甲醇-01%磷酸、乙腈-01%磷酸、甲醇-乙腈-01%磷酸、甲醇-乙腈-01%甲酸構成的洗脫系統，分別進行等度與梯度洗脫。結果表明，甲醇-乙腈-01%磷酸系統進行梯度洗脫的分析效果較好。

血府逐瘀水蜜丸與已有國家藥典標準的血府逐瘀大蜜丸相比，制劑工藝中增加了加熱干燥過程，而且中藥復方制劑化學成分復雜。為更有效保證藥品質量，全面提升藥品質量控制標準，實驗采用HPLC法同時測定血府逐瘀水蜜丸中梓醇、羥基紅花黃色素A及藁本內酯三種熱不穩定性成分的含量。該方法重現性好，操作簡便，結果準確可靠，能夠綜合評價血府逐瘀水蜜丸在干燥后的內在質量，在藥典標準的基礎上提高了血府逐瘀丸的質量控制水平，可用于血府逐瘀水蜜丸的制劑工藝研究中干燥溫度的考察及控制中間體的質量，并為血府逐瘀水蜜丸的質量標準的制定提供依據。

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（編輯：穆麗華）