3個(gè)白樺BpBEE基因的克隆與表達(dá)分析

武丹陽，楊 洋，李慧玉

（東北林業(yè)大學(xué) 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150040）

3個(gè)白樺BpBEE基因的克隆與表達(dá)分析

武丹陽，楊 洋，李慧玉

（東北林業(yè)大學(xué) 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150040）

根據(jù)已有的白樺Betula platyphylla莖尖、葉片及木質(zhì)部等45個(gè)轉(zhuǎn)錄組信息，獲得3條白樺BEE基因的全長cDNA序列，分別命名為BpBEE1,BpBEE2和BpBEE3。對(duì)3個(gè)BpBEE基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析，結(jié)果表明：3個(gè)基因具有典型的結(jié)合DNA及特異識(shí)別序列E-box和N-box，屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。這3個(gè)基因與擬南芥Arabidopsis thaliana中AtBEE基因親緣關(guān)系較近，屬于bHLH超家族第25亞類。在白樺生長季內(nèi)，BpBEE1,BpBEE2和BpBEE3在不同組織中均有表達(dá)，葉中BpBEE基因表達(dá)量明顯高于其他部位。在生長旺盛時(shí)期，莖、葉和頂芽中BpBEE基因均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，表明BpBEE基因可能參與到白樺的生長過程。油菜素內(nèi)酯（BR）激素處理之后，BpBEE1在早期（2 h和4 h）的芽和木質(zhì)部中呈顯著上調(diào)（＞2倍）；BpBEE2在早期（2 h）的木質(zhì)部和芽顯著上調(diào)外，其他處理時(shí)間也呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)。表明3個(gè)白樺BpBEE基因參與BR激素應(yīng)答，且BpBEE1和BpBEE2呈現(xiàn)早期應(yīng)答響應(yīng)。圖5表2參16

林木育種學(xué)；白樺；bHLH轉(zhuǎn)錄因子；基因克隆；基因表達(dá)分析

Basic helix-loop-helic（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子是一類在生物界廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，通過特定的氨基酸殘基與靶基因相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)［1］。依據(jù)進(jìn)化關(guān)系及與DNA的結(jié)合模式，將動(dòng)物中bHLH轉(zhuǎn)錄因子分為A~F等6個(gè)家族，植物bHLH蛋白大多屬于B組［2］。擬南芥Arabidopsis thaliana中有147個(gè)bHLH基因，水稻Oryza sativa中有167個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子［3］。CARRETERO-PAULE等［3］對(duì)擬南芥、水稻、苔蘚和藻類全基因組的bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了系統(tǒng)分析，這4類植物中所有638個(gè)bHLH基因被分為32個(gè)亞家族，主要特征是含有約60個(gè)氨基酸的bHLH結(jié)構(gòu)域，可以分為長度15個(gè)氨基酸左右的堿性氨基酸區(qū)和45個(gè)氨基酸左右的α螺旋-環(huán)-α螺旋區(qū)（HLH區(qū)）［4］，并且定義了植物bHLH的保守區(qū)域，即堿性氨基酸區(qū)含有高度保守的H5-E9-R13序列（His5-Glu9-Arg13），這為鑒定新的bHLH轉(zhuǎn)錄因子提供了依據(jù)［3］。bHLH基因參與植物的生長發(fā)育，促進(jìn)花形態(tài)的建成和抑制及種子的萌發(fā)，控制氣孔細(xì)胞分化及保衛(wèi)細(xì)胞形成［5］。bHLH還參與植物適應(yīng)非生物逆境反應(yīng)［6］。擬南芥中AtbHLH92表達(dá)受鹽、干旱、滲透和寒冷等多種脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，陸地棉Gossypium hirsutum中分離的GhbHLH1被ABA，干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)［7］；過表達(dá)水稻OsbHLH001轉(zhuǎn)錄因子的擬南芥抗鹽及抗凍能力均得到的提高［1］。之外，bHLH還參與生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，bHLH類基因OSB1，ATR2和IND分別參與花青素、色氨酸及赤霉素的合成；PIF3，PIF4和HFR1在光敏色素信號(hào)傳導(dǎo)中起調(diào)控作用；BEE1，BEE2和BEE3在油菜素內(nèi)酯（brassinolid，BR）的信號(hào)傳導(dǎo)中起作用［8］。BEE（BR enhanced expression）所編碼的蛋白質(zhì)是屬于bHLH超家族的一員，是調(diào)控BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要元件［8］。迄今為止對(duì)BEE基因的研究積累較少。在擬南芥中，3個(gè)BEE基因在BR信號(hào)途徑中是早期應(yīng)答受體［8］。擬南芥BEE基因突變體出現(xiàn)植株矮小和開花延遲的表型，且該家族成員存在功能冗余［8］。在木本植物中BEE基因的功能研究未見報(bào)道。白樺Betula platyphylla是樺木科Betulaceae樺木屬Betula的落葉喬木，天然次生林更新的先鋒樹種，也是中國重要的經(jīng)濟(jì)樹種之一。油菜素內(nèi)酯是對(duì)植物生長發(fā)育有多方面調(diào)節(jié)作用的植物激素，對(duì)植物生長發(fā)育有著多方面的重要影響。本研究以白樺為材料，克隆了3條BpBEE基因，通過生物信息學(xué)及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，對(duì)BpBEE在白樺不同生長階段的表達(dá)變化及響應(yīng)BR處理的情況進(jìn)行了研究，旨在深入揭示BpBEE基因功能，探索它在木本植物BR信號(hào)途徑的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

基因表達(dá)分析材料采自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種試驗(yàn)基地10年生的白樺。雌花序出現(xiàn)于4月中下旬,始花5~10 d后開始受粉,持續(xù)1周左右，雄花序出現(xiàn)于5月底,8月中旬結(jié)束。白樺的雄配子體發(fā)育很特殊,在當(dāng)年不形成成熟的雄配子體,直到第2年4月中下旬才發(fā)育成熟，稱為越冬宿存現(xiàn)象［9］。2013年6月5日至9月20日，隔15 d取材1次，每次均選取相同3株白樺中部的雄花序、葉片、嫩莖和頂芽，分別混樣。越冬后第2年4月15日至4月25日，隔5 d采取雄花序和雌花序。植物材料經(jīng)液氮速凍后，放入－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

BR處理以1年生、長勢(shì)一致的白樺無性系為材料。噴灑0.2 mg·L－1的BR（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫 80）溶液 5.0 mL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照（噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1%吐溫 80溶液 5.0 mL），在處理0，2，4，6，12，24，48和72 h后，分別采集頂芽、葉、木質(zhì)部和韌皮部。液氮冷凍處理，－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 BpBEE基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)研究團(tuán)隊(duì)已有的白樺不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得3個(gè)BEE基因的全長cDNA序列，分別命名為BpBEE1，BpBEE2，BpBEE3。

利用美國生物技術(shù)信息中心（NCBI）在線開放閱讀框（ORF）尋找程序確定基因的開放讀碼框；利用Conserved Domains工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struct-ure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)保守區(qū)及蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)域。對(duì)蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)進(jìn)行了在線計(jì)算［http://web.expasy.org/protparam/。根據(jù)白樺基因組DNA序列（白樺基因組測(cè)序、拼接工作已經(jīng)完成，數(shù)據(jù)尚未公布）在GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/］上對(duì)其基因組序列進(jìn)行外顯子和內(nèi)含子的預(yù)測(cè)。用BioEdit中的ClustalW進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)；選取白樺和擬南芥AtBEE基因序列，使用MEGA 5.1以默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建鄰接樹（neighbor-joining tree，NJ-tree），其中Bootstrap分析進(jìn)行1 000次重復(fù)。

1.3 總RNA的提取與檢測(cè)

采用RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，RP3302），按說明書提取白樺不同組織部位的總RNA。用微量紫外檢測(cè)儀NanoDrop測(cè)定提取的RNA樣品濃度，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.4 RNA反轉(zhuǎn)錄

利用PrimeScriptTMRT reagentkit（TaKaRa）進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系和條件參照試劑盒說明書操作。

1.5 實(shí)時(shí)定量分析

根據(jù)已知的3個(gè)BpBEE全長序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物，同時(shí)以白樺α-Tubulin為內(nèi)標(biāo)基因（引物序列參見表1）。以獲得的白樺不同生長階段材料（雌花、雄花、莖、葉和頂芽）及BR處理后不同時(shí)間（0，2，4，6，12，24，48和72 h）收集的組織（頂芽、葉、木質(zhì)部和韌皮部）cDNA稀釋10倍作為模板。熒光定量反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq10.0 μL，上、下游引物（10 mmol·L－1）各0.8 μL，Rox DyeⅡ0.4 μL，cDNA 2.0 μL，加水至終體積20.0 μL。反應(yīng)在ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀上進(jìn)行，程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，循環(huán)40次，繪制溶解曲線，溫度由95℃15 s，60℃1 min，至95℃15 s止，重復(fù)3次·反應(yīng)－1，采用－ΔΔCt算法分析結(jié)果。

表1 定量RT-PCR分析所用引物Table 1 Primers used in RT-PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)BpBEE基因全長的生物信息學(xué)分析

根據(jù)白樺基因組信息，對(duì)3個(gè)基因的基因組序列進(jìn)行分析，結(jié)果BpBEE1，BpBEE2及BpBEE3基因的基因組序列長度差異較大，其中BpBEE1基因組序列最長，達(dá)2 700 bp，BpBEE2和BpBEE3基因分別為1 600 bp和1 400 bp，但3個(gè)基因的內(nèi)含子和外顯子數(shù)目一致，均含有6個(gè)外顯子5個(gè)內(nèi)含子，且BpBEE1的5個(gè)內(nèi)含子長度（110，140，574，106和982 bp）均比BpBEE2的內(nèi)含子（134，80，72，127和73 bp）長，BpBEE3內(nèi)含子長度依次為82，11，104，91和146 bp（圖1）。BpBEE1和BpBEE3編碼的氨基酸數(shù)目接近，分別為263和269個(gè)氨基酸，BpBEE2編碼的氨基酸序列較長，為360個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)的范圍為5.3~6.5（表2）。

美國生物技術(shù)信息中心BLAST序列分析表明，BpBEE1，BpBEE2和BpBEE3所編碼的蛋白具有明顯的bHLH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括2個(gè)螺旋和1個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，含有特異識(shí)別序列E-box（CANNTG）和N-box（CACGC/AG）。多重序列比對(duì)結(jié)果表明：白樺BpBEE基因所編碼的bHLH結(jié)構(gòu)域與bHLH氨基酸序列中的嚴(yán)格保守的位點(diǎn)完全一致，包括堿性結(jié)構(gòu)域中第9位組氨酸，第13位谷氨酸與第16位、第17位的精氨酸，螺旋區(qū)域中第10位的亮氨酸（圖2）。白樺BpBEE2與擬南芥AtBEE2基因的氨基酸同源性高達(dá)87%，BpBEE3與擬南芥AtBEE1和AtBEE3基因的氨基酸同源性高達(dá)為90%，BpBEE1也與擬南芥中AtBEE1和AtBEE3基因的氨基酸同源性達(dá)到55%。分子進(jìn)化樹表明，白樺BpBEE1，AtBEE2，AtBEE3基因聚為一類，均與擬南芥AtBEE基因同源性較高。根據(jù)已有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子分類情況，白樺Bp-BEE基因在bHLH蛋白家族中屬于第25亞類（圖3）。

圖1 BpBEE基因的結(jié)構(gòu)Figure 1 Structure of BpBEE genes

表2 3個(gè)BpBEE基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physico-chemical properties of BpBEEs genes

圖2 BpBEE和AtBEE蛋白的多序列比對(duì)Figure 2 Multiple protein sequence alignment result between BpBEE and AtBEE

2.2 3個(gè)BpBEE基因在白樺不同組織部位的表達(dá)模式

利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)3個(gè)BpBEE基因在不同時(shí)間和不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：雌花中（參考組織為2014年4月15日BpBEE1表達(dá)量），BpBEE1基因隨著雌花的發(fā)育表達(dá)量逐漸降低，在4月25日達(dá)到最低值，下調(diào)2－1.8倍。BpBEE2基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，但是表達(dá)量逐漸減少。而BpBEE3呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)，下調(diào)最低峰出現(xiàn)在4月20日（2－2.0倍），而后顯著上調(diào)（24.0倍）（圖4）。

在雄花發(fā)育初期，3個(gè)BpBEE的表達(dá)豐度下調(diào)或不變（參照組織為2014年4月15日BpBEE1基因表達(dá)量），在發(fā)育中期（7月5日到8月5日）BpBEE2和BpBEE3基因上調(diào)表達(dá)，上調(diào)倍數(shù)在22.0~24.0，而越冬后3個(gè)基因均成下調(diào)表達(dá)，尤其以BpBEE3最為明顯（圖4）。

莖中3個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)不盡相同（參考組織為2013年6月5日BpBEE1基因表達(dá)量）。BpBEE1在發(fā)育初期呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，到發(fā)育中期依然上調(diào)表達(dá)但表達(dá)量有所減少，到8月20日出現(xiàn)下調(diào)最低峰（2－1.0倍），而后顯著上調(diào)（23.0倍）。BpBEE2基因呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)趨勢(shì)，在7月5日出現(xiàn)上調(diào)最高峰（25.0倍），隨后仍呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)但是表達(dá)量逐漸減少。而BpBEE3基因在整個(gè)發(fā)育階段大部分呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，但是變化量小，在6月20日達(dá)到下調(diào)最低峰（2－1.8倍），在9月5日出現(xiàn)了明顯的上調(diào)趨勢(shì)（23.0倍）（圖4）。

在葉中，BpBEE1和BpBEE2基因表達(dá)量隨著生長持續(xù)上調(diào)（參考組織為2013年6月5日BpBEE1基因表達(dá)量），8月20日達(dá)到最高值（27.0~28.0倍），9月5日表達(dá)量顯著減少。BpBEE3在發(fā)育初期呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，隨后持續(xù)上調(diào)（24.5~24.8倍），在9月5日達(dá)到下調(diào)最低峰（2－2.5倍）（圖4）。

圖3 BpBEE氨基酸序列與擬南芥bHLH氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure 3 Phylogenetic tree of amino acid sequences of BpBEE with bHLHs from Arabidopsis thaliana

在頂芽中，BpBEE1基因在發(fā)育初期表達(dá)量較低（參考組織為2013年6月5日BpBEE1基因表達(dá)量），在發(fā)育的旺盛時(shí)期7月5日達(dá)到最高峰（22.0倍）隨后表達(dá)量逐漸降低，在9月5日達(dá)到最低點(diǎn)。BpBEE2和BpBEE3的表達(dá)規(guī)律是相同的，發(fā)育初期下調(diào)表達(dá)，發(fā)育的旺盛時(shí)期上調(diào)表達(dá)，發(fā)育后期表達(dá)量減少甚至下調(diào)表達(dá)。這表明基因?qū)τ陧斞康陌l(fā)育有影響。

2.3 BR處理下BpBEE的表達(dá)模式

利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了BpBEE1，BpBEE2和BpBEE3對(duì)BR激素的響應(yīng)。結(jié)果顯示：在芽中BpBEE2和BpBEE3的表達(dá)趨勢(shì)相似，4~48 h均為下調(diào)表達(dá)（不同組織以0 h取材的BpBEE1基因的表達(dá)量為參照），分別在6 h和24 h達(dá)到下調(diào)的最低值（2－2.0和2－4.5倍）。而BpBEE1與其相反，早期（2 h和4 h）上調(diào)表達(dá)，在中后期下調(diào)表達(dá)，上調(diào)表達(dá)最高值在處理2 h出現(xiàn)（21.8倍）（圖5），這與擬南芥中AtBEE基因是BR信號(hào)通路中的早期應(yīng)答受體的結(jié)果相符合［8］。

在葉中，3個(gè)BpBEE基因的表達(dá)趨勢(shì)相同，表達(dá)豐度均低于處理前。BpBEE1在早期（6 h）表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，在中后期的表達(dá)呈現(xiàn)波動(dòng)狀，但是在20和2－2.0倍之間波動(dòng)。BpBEE2出現(xiàn)了較為明顯的下調(diào)表達(dá)，并在48 h時(shí)出現(xiàn)了最低值（2－2.0倍）。BpBEE3的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)，在6 h達(dá)到了最低值（2－6.0倍）（圖5）。

在木質(zhì)部中，BpBEE1在BR處理后表達(dá)量升高，BpBEE1在4 h達(dá)到了最高值（22.0倍）。BpBEE2在處理后呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，但是表達(dá)量均低于處理前。BR處理后BpBEE3下調(diào)表達(dá)，最低值出現(xiàn)在6 h（2－4.5倍）。

在韌皮部中，BpBEE1和BpBEE3基因表達(dá)趨勢(shì)相似，均為下調(diào)表達(dá)，分別在48 h和6 h時(shí)達(dá)到表達(dá)最低值（2－3.0倍和2－5.5倍），而BpBEE2在BR處理0 h時(shí)為上調(diào)表達(dá)，處理后呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)， 24 h達(dá)到最低值（2-4.0倍）（圖5）。

圖4 BpBEE基因在不同時(shí)期不同組織部位的表達(dá)分析Figure 4 Expression patterns of BpBEE genes

以上結(jié)果表明：BR激素影響B(tài)pBEE基因的表達(dá)量，在不同組織部位的影響不同。

3 討論

真核生物中bHLH蛋白是一大類轉(zhuǎn)錄因子，已在多種生物的基因組中得到鑒定［10］。植物中bHLH家族成員數(shù)量眾多，僅次于MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族，在擬南芥中bHLH轉(zhuǎn)錄因子超過140個(gè)，水稻中則多于160個(gè)［5］。根據(jù)白樺基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析預(yù)測(cè)白樺中含有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子有157個(gè)。bHLH蛋白主要特征是含有bHLH結(jié)構(gòu)域，白樺BpBEE均含有62個(gè)氨基酸組成的bHLH結(jié)構(gòu)域，并存在高度保守的序列［11］，對(duì)bHLH與靶DNA的結(jié)合密切相關(guān)。同時(shí)通過序列分析BpBEE能識(shí)別E-box（CANNTG）并結(jié)合，進(jìn)而激發(fā)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄［2］。

在進(jìn)化上，一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的內(nèi)含子/外顯子的剪切位點(diǎn)也是十分保守的，所以它對(duì)于基因家族的進(jìn)化研究也是非常重要的證據(jù)［12］。在植物的bHLH蛋白超家族中，其內(nèi)含子的位置十分保守，但數(shù)量具有多樣化的特點(diǎn)，最常見的是含有2或3個(gè)內(nèi)含子［12］，也有個(gè)別基因含有更多數(shù)目的內(nèi)含子。例如，擬南芥AtBEE基因含有4~5個(gè)內(nèi)含子和5~6個(gè)外顯子［11］。白樺BpBEE基因含有的內(nèi)含子數(shù)目一致，均含有5個(gè)內(nèi)含子，故在親緣關(guān)系上比較相近。

進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，BpBEE1，BpBEE2和BpBEE3屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子的第25亞類，與擬南芥中AtBEEs同源性較高［13］。已有研究報(bào)道，擬南芥第25亞類中共有17個(gè)成員，其中包括AtBEE1，At-BEE2，AtBEE3和AtCIB1基因，這些基因參與激素信號(hào)途徑和器官的發(fā)育［11］。AtBEEs基因表達(dá)受BR和脫落酸（ABA）的誘導(dǎo)，在噴灑植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)BR后，AtBEE基因的表達(dá)量明顯高于未處理前，擬南芥幼苗的胚軸也有一定程度的增長；而ABA的效果與BR相反，在噴灑植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)后AtBEE基因的表達(dá)量降低［8］。AtCIB1基因所編碼的蛋白質(zhì)可以調(diào)控光誘導(dǎo)基因的表達(dá)，從而控制植物的成花轉(zhuǎn)變［14］。擬南芥隱花色素CRY2與bHLH轉(zhuǎn)錄因子CIB1發(fā)生互作，CIB1能夠和成花素FT基因啟動(dòng)子區(qū)的E-box（CANNTG）結(jié)合，從而促進(jìn)FT表達(dá)，而FT編碼一個(gè)可移動(dòng)的轉(zhuǎn)錄因子，從葉片轉(zhuǎn)移到莖端分生組織促進(jìn)開花基因的表達(dá)，最終促進(jìn)光周期控制的開花［15］。在本研究中，3個(gè)BpBEE基因在不同組織部位的表達(dá)呈現(xiàn)出一定程度的相似性，預(yù)測(cè)其在功能上有一定的冗余，但也有很多不同點(diǎn)。在生長旺盛時(shí)期，3個(gè)BpBEE基因在葉、頂芽和莖中均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)；在雄花的減數(shù)分裂時(shí)期，BpBEE2和Bp-BEE3基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，故我們認(rèn)為白樺BpBEE基因參與到了植物的生長發(fā)育過程中。在進(jìn)行BR激素處理之后，3個(gè)BpBEE基因的表達(dá)量都明顯的變化，在處理早期0~6 h期間，BpBEE1和BpBEE2基因的表達(dá)量有明顯的變化，表明BpBEE基因參與對(duì)BR激素應(yīng)答，BpBEE1與BpBEE2表現(xiàn)為早期應(yīng)答反應(yīng)。在擬南芥中AtBEEs基因作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多個(gè)基因，例如BRI1，BIMs，BIN2和BZR2基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)BR信號(hào)途徑［16］。本研究的3個(gè)基因與其同源性較高，BpBEE基因是否具有相同的調(diào)節(jié)功能，及對(duì)下游基因及表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究揭示。

圖5 BR處理對(duì)BpBEE基因表達(dá)的影響Figure 5 Effects of BR treatment on BpBEE gene expression

［1］ 劉曉月，王文生，傅彬英，等.植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的功能研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)進(jìn)展，2011，1（6）：391－397.

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Cloning and expression of three BpBEE genes in Betula platyphylla

WU Danyang,YANG Yang,LI Huiyu
（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040,Heilongjiang, China）

Based on the transcriptome sequences from 45 libraries of stem tips,leaves,and xylem of Betula platyphylla （birch）,three BEE genes （BpBEE1,BpBEE2,and BpBEE3）,were obtained bioinformatics and expression patterns of three genes were analyses.Results showed that three BpBEE genes belonged to basic helix-loop-helix（bHLH）transcription factor superfamily,and contained a typical DNA binding domain and E-box/N-box specificity sites.These genes were highly homologous to AtBEE genes,and belonged to the 25thsubclass in the bHLH superfamily.During the growing season,the RNA level of all three BpBEE genes were highestin leaves than in others tissues.In the vigorous growing stage,All BpBEE genes were up-regulated in leaves and buds.With the brassinosteroids （BR）treatment,BpBEE1 was up-regulated in buds and xylem （＞ 2 times）in the early stages （2 h and 4 h）;whereas,BpBEE2 was up-regulated in the xylem and buds in the early stage（2 h）.These results suggested that the three BpBEE genes could be involved in the growth process of birch,and response for BR hormone,BpBEE1 and BpBEE2 showeds early reply responses,especially.［Ch, 5 fig.2 tab.16 ref.］

forest tree breeding;Betula platyphylla;bHLH transcription factors;gene cloning;gene expression analysis

S722.3

A

2095-0756（2017）01-0137-08

2016-01-17；

2016-04-13

“十二五”國家科技計(jì)劃農(nóng)村領(lǐng)域項(xiàng)目（2013AA102704）

武丹陽，從事林木遺傳育種研究。E-mail：wudanyang_nm@126.com。通信作者：李慧玉，副教授，博士，從事林木遺傳育種研究。E-mail:lihuiyu0519@aliyun.com

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報(bào)，2017，34（1）：145-151

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.020