高效液相色譜-三重四級桿質譜法測定豆制品中二甲基黃、二乙基黃

林 欽，黃紅霞，張 莉，嚴 恒，李道霞，劉 美，李曉瑜，黃 瑛

（1.福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002；2.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北 武漢 430070；3.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川 成都 610097；4.國家食品藥品監督管理總局，北京 100053）

高效液相色譜-三重四級桿質譜法測定豆制品中二甲基黃、二乙基黃

林 欽1，黃紅霞1，張 莉2，嚴 恒2，李道霞3，劉 美3，李曉瑜4，黃 瑛3

（1.福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002；2.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北 武漢 430070；3.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川 成都 610097；4.國家食品藥品監督管理總局，北京 100053）

建立一種同時測定豆制品中二甲基黃、二乙基黃的高效液相色譜-三重四級桿質譜（HPLC-MS/MS）方法。對提取溶劑及色譜條件進行優化，粉碎后的樣品經乙腈提取，提取液以HPLC-MS/MS測定，外標法定量。二甲基黃、二乙基黃在3min內流出并完全分離，兩者在0.05～10μg/L范圍內相關系數r2均大于0.999，二甲基黃在0.5～50μg/kg的加標回收率為90.0%～93.4%，RSD為0.5%～5.1%，二乙基黃在0.5～50μg/kg水平的加標回收率在84.6%～93.8%，RSD為1.1%～4.6%，檢出限兩者均為0.2 μg/kg。該方法操作簡捷、準確度和精密度高，適用于豆制品中二甲基黃、二乙基黃的檢測。

二甲基黃；二乙基黃；高效液相色譜-三重四級桿質譜；豆制品

0 引 言

二甲基黃（methyl yellow）[1]、二乙基黃（ethyl yellow）[2-3]是偶氮苯類化工染料，不允許在食品中使用，有研究報道二甲基黃可能使實驗動物患癌[4]。香港食物環境衛生署食物安全中心2014年12月6日發布了關于從臺灣豆干制品檢出二甲基黃的新聞，12月24日臺灣食品藥物管理部門公布了豆制品乳化劑中又驗出另一種致癌物二乙基黃。為排查風險隱患，福建省產品質量檢驗研究院研究提出了食品中二甲基黃的檢測方法，湖北省食品質量安全監督檢驗研究院提出了二乙基黃的檢測方法。四川食品藥品檢驗檢測院作為全國豆制品抽檢監測工作牽頭單位，整合修改了兩種檢測方法，形成了同時測定豆制品中二甲基黃、二乙基黃的高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS），并經北京市海淀區產品質量監督檢驗所、河北省食品檢驗研究院等5家機構驗證表明效果良好。目前文獻報道的可用于二甲基黃的測定方法主要有HPLC[5-8]、LC-MS[9-12]、GC-MS[13]，液相色譜法的選擇性較差、靈敏度低，易造成假陽性的檢測結果。迄今尚未見文獻報道食品中二乙基黃的檢測方法。本文建立的方法可同時用于檢測食品中的二甲基黃、二乙基黃，樣品前處理較文獻[12]報道的更為快速、簡便，且測得二甲基黃的線性及回收率均較文獻報道的更好。本方法將三重四級桿質譜用于同時檢測二甲基黃和二乙基黃，具有很高的選擇性和靈敏度，兩對定性離子同時監測有利于測定準確性，能有效避免假陽性結果的發生。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

超高效液相色譜儀Waters Acquity UPLC系統配Quattro Premier XE串聯四級桿質譜儀（美國Waters公司）；渦旋混勻器（美國熱電公司，MIXII）；冷凍高速離心機 （美國貝克曼公司，Avanti J-E）；Milli-Q超純水純化系統 （美國 Millipore公司）；超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司，KQ-800KDE）；分析天平（賽多利斯北京有限公司，BSA224S）。

1.2 材料與試劑

二甲基黃、二乙基黃對照品，純度均大于98%（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH）；豆制品試驗樣品（超市購買和網購）；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（美國Fisher公司）；氯化鈉為分析純 （上海國藥集團）；水為Milli-Q超純水純化系統制備的去離子水。

1.3 對照溶液配制

1.3.1 對照儲備液

準確稱取適量二甲基黃、二乙基黃對照品，分別用乙腈制成質量濃度為10.0 mg/L的對照儲備液，4℃下保存，有效期6個月。

1.3.2 基質對照工作液

分別準確量取二甲基黃、二乙基黃對照儲備液5.0mL，用乙腈定容至同一100mL容量瓶中，即得混合對照溶液，質量濃度均為0.5mg/L。準確移取混合對照溶液適量，用乙腈分別稀釋至0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 μg/L，即得混合對照系列溶液。

分別精密量取上述混合對照系列溶液1.0 mL，氮吹至近干后，用1.0 mL空白基質（不含二甲基黃、二乙基黃的樣品溶液）復溶，即得基質對照工作溶液，質量濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00μg/L。

1.4 樣品前處理

稱取粉碎后的豆制品試樣約2 g（精確至1 mg）置50mL的離心管中，加入5mL水，渦旋混勻，準確加入 20.0 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取 30 min（溫度控制在室溫以下），再加入2.0g氯化鈉，混勻后于10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.2 μm有機濾膜，續濾液供測定。

1.5 液相色譜與質譜條件

1.5.1 色譜條件

表1 梯度洗脫程序

表2 二甲基黃、二乙基黃主要質譜參數

1.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧（ESI）離子源；離子化模式：正模式；監測方式：多反應監測（MRM）；毛細管電壓3.50kV；源溫度120℃；脫溶劑氣溫度400℃；脫溶劑氣流量700 L/h；錐孔反吹氣流量50 L/h；碰撞室壓力2.7×10-3Mbar（1bar=1×105Pa）；電子倍增管電壓650V。二甲基黃、二乙基黃定性離子、定量離子及碰撞能量等質譜參數見表2。

表3 回收率和精密度試驗結果（n=6）

2 結果與驗證

2.1 樣品提取條件的優化

圖1 二甲基黃、二乙基黃空白基質加標的液相色譜-串聯質譜MRM色譜圖

試驗中嘗試以甲醇作為提取溶劑，進行直接提取測定，但結果顯示，甲醇提取干擾較大，不同添加水平的回收率均偏高，故選取乙腈+水作為提取溶劑，并采用鹽析的方法分離乙腈與水。實驗中比較了乙腈（20 mL）、乙腈+水（20 mL+2 mL）、乙腈+水（20mL+5mL）3種不同溶劑對二甲基黃、二乙基黃的提取效果。當只用乙腈提取時，回收率明顯偏低，只有60%左右，而加入水后回收率明顯上升；由于當水的加入量為2mL時，樣品易結塊，無法完全浸潤，且在加入氯化鈉后分層不明顯，當水的加入量為5mL時則效果良好，因此，實驗選取乙腈+水（20 mL+5 mL）作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的選擇

實驗中考察了0.1%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈、0.5%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈兩種流動相的分離效果，通過對比譜圖，發現0.1%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈分離效果更好，峰形尖銳，對稱性好，靈敏度更高，故選擇0.1%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈作為流動相,通過優化洗脫梯度（見表1），二甲基黃、二乙基黃空白基質加標分離譜圖見圖1，空白樣品譜圖見圖2。

圖2 空白樣品總離子流色譜圖

2.3 線性范圍及檢出限

取基質加標對照工作液，依次進樣測定，以質量濃度為橫坐標，以定量離子峰面積為縱坐標，制作標準工作曲線，二甲基黃、二乙基黃在0.05～10 μg/L范圍內線性關系良好（r2＞0.999）。取低濃度混合基質加標對照溶液（二甲基黃、二乙基黃質量濃度約為0.05 μg/L）進樣，根據峰高計算信噪比為3時的檢測限和信噪比為 10時的定量限，計算得二甲基黃、二乙基黃的檢出限均為 0.2 μg/kg，定量限均為0.5 μg/kg。

2.4 回收率和精密度試驗

取一豆干樣品，分別加入二甲基黃、二乙基黃混合對照品溶液，按0.5，5，10，50μg/kg水平加標，每個水平平行檢測6份，測得二甲基黃回收率為90.0%～93.4%，RSD為0.5%～5.1%。二乙基黃回收率為84.6%～93.8%，RSD為1.1%～4.6%（見表3）。

2.5 方法驗證

在國家食品藥品監督管理總局的組織下，有5家檢驗機構對該方法進行了驗證，二甲基黃、二乙基黃在0.05～10μg/L范圍內線性關系良好（r2＞0.999）。回收率結果顯示，二甲基黃0.5～50 μg/kg水平的加標回收率為89.68%～90.61%，RSD為5.07%～10.94%，二乙基黃0.5～50μg/kg水平加標回收率在83.66%～100.01 %，RSD為5.65%～9.87%。

3 結束語

本實驗考察了樣品的前處理方法，優化了色譜條件和質譜參數，建立了同時測定豆制品中二甲基黃、二乙基黃的高效液相色譜-三重四級桿質譜（HPLCMS/MS）方法。所建方法二甲基黃、二乙基黃分離良好，兩對定性離子同時監測有利于測定結果的準確性，能有效避免假陽性結果的發生。應用建立的方法檢測國內豆干和腐竹200批，均未檢出二甲基黃、二乙基黃。本檢測方法前處理快速、簡便，檢測靈敏度高，定性結果準確。經5家檢驗機構驗證，該方法線關系r2＞0.999、回收率二甲基黃為89.68%～90.61%、二乙基黃為83.66%～100.01%，相對標準偏差二甲基黃為 5.07%～10.94%、二乙基黃為 5.65%～9.87%，檢出限兩者均為0.2 μg/kg。本方法線性范圍、回收率、精密度、檢出限等均能滿足檢測要求和質量監管需要，適用于豆制品中二甲基黃、二乙基黃的同時檢測。

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（編輯：莫婕）

Simultaneous determination of methyl yellow and ethyl yellow in soy products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LIN Qin1，HUANG Hongxia1，ZHANG Li2，YAN Heng2，LI Daoxia3，LIU Mei3，LI Xiaoyu4，HUANG Ying3
（1.Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，Fuzhou 350002，China；2.Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test，Wuhan 430070，China；3.Sichuan Institute for Food and Drug Control，Chengdu 610097，China；4.China Food and Drug Administration，Beijing 100053，China）

To establish a method for determination of methyl yellow and ethyl yellow in soy products using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）. According to the optimization of extraction solvent and chromatographic conditions，the samples were extracted by acetonitrile and determined by HPLC-MS/MS using external standard method. Methyl yellow and ethyl yellow were separated completely within 3min.The linearity of methyl yellow and ethyl yellow was 0.05-10μg/L with correlation coefficients（r2）above 0.999.Recoveries ranged from 90.0%to 93.4%for methyl yellow at spiked levels ranging from 0.5μg/kg to 50μg/kg，and the relative standard deviations（RSDs）were in the range of 0.5%-5.1%.As for ethyl yellow，recoveries were 84.6%-93.8%at spiked levels ranging from 0.5 μg/kg to 50 μg/kg，and the RSDs were 1.1%-4.6%.The limits of detection were 0.2μg/kg.The method is rapid，simple，accurate and sensitive.It is suitable for determination of methyl yellow and ethyl yellow in soy products.

methyl yellow；ethyl yellow；HPLC-MS/MS；soy products

A

：1674-5124（2017）01-0055-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.01.012

2016-05-21；

：2016-07-18

林 欽（1970-），男，福建福州市人，高級工程師，博士，主要從事食品理化檢驗工作。

黃 瑛（1965-），女，陜西山陽縣人，主任藥師，碩士，主要從事食品安全標準研究。