鐵蛋白基因Fth1的克隆及其在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達

劉偉朱修良李清海

（1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所，杭州 310021；2. 浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院放射科，杭州 310009）

鐵蛋白基因Fth1的克隆及其在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達

劉偉1朱修良2李清海2

（1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所，杭州 310021；2. 浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院放射科，杭州 310009）

旨在構(gòu)建編碼大鼠鐵蛋白重鏈多肽1（ferritin heavy chain 1，F(xiàn)th1）的慢病毒，并檢測其在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（RMSC）中的表達。PCR擴增大鼠Fth1基因，克隆至pLenti-GFP-C慢病毒表達載體，包裝慢病毒，感染RMSC細胞。熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)GFP熒光情況，Western blot檢測Fth1的表達情況，WST-1試劑檢測Fth1慢病毒感染組（RMSC-Fth1）和空載體組（RMSC-GFP）的細胞增殖活性。DNA測序結(jié)果表明，pLenti-GFP-C-Fth1慢病毒載體構(gòu)建成功。包裝慢病毒感染RMSC細胞后，熒光顯微鏡下可見明顯綠色熒光，表明感染成功。Western blot結(jié)果顯示，實驗組細胞裂解液中可檢測到特異的Fth1表達條帶。細胞增殖實驗顯示，與空載體組相比，過表達Fth1并不影響RMSC細胞生長。成功構(gòu)建并包裝攜帶大鼠Fth1基因的慢病毒，其能夠成功感染RMSC細胞并表達Fth1蛋白，且對細胞增殖無明顯影響。

Fth1；磁共振報告基因；慢病毒載體；大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞

核磁共振成像（MRI）由于具有很高的空間分辨率和軟組織對比，能夠靈活、無創(chuàng)地觀察被MR，對比劑標記的目標細胞在體內(nèi)的遷移、分化及增殖情況［1-5］，已成為當前活體檢測和干細胞移植監(jiān)測研究的熱點。目前使用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體探針（轉(zhuǎn)鐵蛋白-單晶氧化鐵超微粒、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體-單晶氧化鐵超微粒）標記細胞進行MRI 觀察，存在一定的缺陷［6-8］，因此，迫切需要發(fā)展一種新的標記方法，實現(xiàn)MRI 技術(shù)對活體標記細胞進行長期監(jiān)測。鐵蛋白可以作為MRI 分子影像學研究的報告分子。除標記后的細胞移植不存在近期和遠期毒副作用外，其對細胞活性、功能、增殖能力、分化能力、凋亡率和氧自由基生成情況均無明顯改變，引起了學者的廣泛關(guān)注［9-13］。鐵蛋白儲存了機體鐵含量的20%-30%，其由重鏈蛋白和輕鏈蛋白兩個亞基構(gòu)成，二者的編碼基因分別定位于不同染色體［14］。研究表明，重鏈蛋白（ferritin heavy chain 1，F(xiàn)TH1）是鐵蛋白行使功能的主要亞單位，含有鐵氧化酶活性中心，負責鐵離子的氧化和整合［15］。目前已經(jīng)有成功的案例，分別在人神經(jīng)母細胞瘤細胞［16］、人乳腺癌細胞［17］和小鼠間充質(zhì)干細胞D1細胞系［18］中成功表達Fth1報告基因。另一方面，通過骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）移植可明顯改善腎病患者的腎臟功能，但BMSCs 移植后，必須明確移植細胞的遷移、成活和分化狀態(tài)，以確認其對疾病癥狀緩解的貢獻［19］。本研究通過構(gòu)建攜帶大鼠Fth1基因的慢病毒，感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（RMSC），體外觀察Fth1的表達及其對細胞生存及增殖的影響，旨為進一步研究移植細胞的活體示蹤奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞RMSC和HEK 293T細胞購自ScienCell生物公司。

1.1.2 目的基因、慢病毒載體及慢病毒包裝系統(tǒng) 大鼠Fth1基因由省心科技有限公司合成。慢病毒載體pLenti-GFP-C（含有GFP報告基因和C-端HA標簽）及慢病毒包裝系統(tǒng)由南京愛必夢公司提供。

1.1.3 主要試劑 引物合成和測序委托擎科生物有限公司完成。限制性內(nèi)切酶和T4連接酶為NEB公司產(chǎn)品。DNA Marker、小鼠抗HA標簽單克隆抗體及HRP標記山羊抗小鼠二抗購自abm生物公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）為Gibco公司產(chǎn)品。2 × super HIFI-MIX II，DNA膠回收試劑盒，WST-1細胞增殖試劑盒購自Sigma公司。大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1購自全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠Fth1基因序列及擴增 根據(jù)從NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得的Rattus norvegicus ferritin heavy chain 1，mRNA序列（Fth1，GenBank：NM_012848.2），人工合成其cDNA序列，以其為模板進行PCR擴增。所用正向引物為Fth1F：5'-CAGTGTGGTGGCCTGCAGGTGAATTCG CCACCATGACCACCGCGTCTCCCTC-3'（下劃線為EcoR I酶切位點），反向引物為Fth1R：5'-CTTGCT CACCATCTCGAGTTTTCTAGAGCTCTCATCACCGTG TCCCAG-3'（下劃線為Xho I酶切位點）。PCR擴增體系為：模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×super HIFI-MIX II 25 μL，滅菌的雙蒸水20 μL。PCR擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共32個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

1.2.2 慢病毒載體構(gòu)建 大鼠Fth1 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化回收，與慢病毒載體pLenti-GFP-C分別經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切、膠回收，獲得帶有黏性末端的目的片段及載體，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布含卡那霉素（50 μg/mL）抗性的LB固體培養(yǎng)基平板篩選，37℃，過夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子用Fth1F、Fth1R引物進行菌落PCR，挑取擴增出目的大小片段的轉(zhuǎn)化子擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后使用EcoR I和Xba I雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，正確的重組質(zhì)粒命名為pLenti-GFP-C-Fth1。

1.2.3 慢病毒包裝和滴度測定 將重組慢病毒質(zhì)粒pLenti-GFP-C-Fth1或空載體質(zhì)粒pLenti-GFP-C及包裝質(zhì)粒進行高純度無內(nèi)毒素抽提后共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，獲得攜帶大鼠Fth1基因的重組慢病毒，以及作為對照的空載體慢病毒，并采用逐孔稀釋法測定病毒滴度。

1.2.4 RMSC細胞的培養(yǎng)及感染 RMSC細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。感染前一天，將細胞鋪于24孔板中，每孔10 000個細胞/500 μL。培養(yǎng)24 h后，分別用Fth1慢病毒及空載體慢病毒以不同的MOI值感染RMSC細胞，繼續(xù)培養(yǎng)2-6 d。觀察細胞形態(tài)及綠色熒光蛋白表達情況。

1.2.5 Western blot檢測 使用Western blot檢測驗證FTH1在RMSC細胞中的表達情況。收獲病毒感染（MOI=100）的RMSC細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，HA一抗（1∶1 000）和FTH1細胞溶液（1∶500）4℃孵育過夜，TBST（TBS + 0.1% Tween 20）洗膜3次后二抗（1∶100 000）室溫孵育1 h，徹底洗膜后使用ECL發(fā)光試劑顯影，曝光。實驗重復3次。

1.2.6 細胞增殖檢測 將RMSC細胞以5 000細胞/100 μL/孔的密度鋪于96孔板，分別使用Fth1慢病毒（RMSC-Fth1）及空載體慢病毒（RMSC-GFP）進行感染后繼續(xù)培養(yǎng)3 d。每天觀察細胞生長情況。感染后第3天，每孔加入10 μL的WST試劑，繼續(xù)孵育30 min，1 h和4 h，分別在3個時間點使用酶標儀在OD450nm下測量各孔光密度值。

2 結(jié)果

2.1 pLeni-GFP-C-Fth1載體的構(gòu)建及鑒定

大鼠Fth1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析后，在500-600 bp之間有一條特異性條帶，大小與目的基因長度相符（圖1）。產(chǎn)物經(jīng)純化、EcoR I和Xba I雙酶切后，與含有相同黏性末端的pLeni-GFP-C載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1，通過菌落PCR篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒后進行雙酶切驗證（圖2），切下的小片段與Fth1基因PCR產(chǎn)物大小吻合，而大片段與pLeni-GFP-C載體的長度吻合，說明基因片段與載體正確連接。進一步經(jīng)DNA測序確定連入的基因片段正確無誤，慢病毒載體構(gòu)建成功。

圖1 PCR擴增大鼠Fth1結(jié)果

圖2 pLeni-GFP-C-Fth1載體酶切電泳圖

2.2 慢病毒包裝及滴度測定

將慢病毒質(zhì)粒pLenti-GFP-C-Fth1或空載體質(zhì)粒pLenti-GFP-C及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，獲得攜帶大鼠Fth1基因的重組慢病毒，以及作為對照的空載體慢病毒。采用逐孔稀釋法測定病毒滴度約為3×108TU/mL。

2.3 慢病毒感染RMSC細胞以及目的基因表達的檢測

2.3.1 熒光顯微鏡觀察細胞中綠色熒光蛋白的表達 分別將Fth1重組慢病毒和空載體慢病毒以不同MOI值感染RMSC細胞。感染后72 h，熒光顯微鏡下觀察顯示RMSC細胞內(nèi)可見明顯的綠色熒光（圖3），表明慢病毒成功感染RMSC細胞。MOI=100時，細胞毒性相對較小并可取得較滿意的感染效果，感染陽性率＞80%。

2.3.2 Western blot檢測Fth1蛋白的表達 Western blot結(jié)果（圖4）顯示，與空載體慢病毒感染細胞相比，F(xiàn)th1重組慢病毒感染細胞在42 kD處檢測到特異條帶。該條帶與目的蛋白FTH1的預計分子量（21.2 kD）不符，但正好為其2倍，推測可能是FTH1蛋白形成了二聚體。

圖3 熒光顯微鏡觀察慢病毒感染RMSC細胞72 h后綠色熒光蛋白表達情況

圖4 Western blot檢測骨髓間充質(zhì)干細胞中Fth1表達

2.4 細胞增殖活性檢測

實驗結(jié)果（圖5）顯示，鋪板后72 h，與空載體對照組相比，F(xiàn)th1慢病毒感染并未影響細胞增殖，加入WST-1試劑后30 min、1 h及4 h時的吸光度測量結(jié)果均無顯著差異。30 min內(nèi)感染與未感染的細胞增殖速度有所不同，隨著時間延長，1 h和4 h之間含有Fth1基因的慢病毒對大鼠間充質(zhì)干細胞增殖無顯著影響。

圖5 細胞增殖活性檢測

3 討論

IgA 腎病是慢性腎小球腎炎中最常見的一種類型，在我國約占腎活檢患者總數(shù)的40%-47%［20，21］。Herrera和Qian等［22，23］的研究表明，BMSCs 參與了腎臟損傷的修復，為IgA腎病的治療提供了新的策略。本研究的主要目的就是選擇鐵蛋白作為報告基因，將鐵蛋白和GFP修飾的BMSCs移植到IgA腎病模型鼠體內(nèi)，以期未來通過磁敏感加權(quán)成像（SWI）動態(tài)監(jiān)測干細胞在腎臟區(qū)域的分布、增殖及分化情況；同時通過相位值的測定來評估BMSCs在體內(nèi)的增殖情況，為干細胞移植治療效果的長期隨訪評估提供一種無創(chuàng)性的影像學手段。

以往大部分研究主要集中在Fth1報告基因在腫瘤細胞中的表達［24-28］，在干細胞中進行重鏈蛋白表達的研究很少，在骨髓間充質(zhì)干細胞中目前還未見報道。在實驗前期，我們采用了腺病毒感染的方式進行基因轉(zhuǎn)染，但是只有血清型4和8有陽性信號，且感染陽性率僅為5%。而使用慢病毒大大提高了感染效率。Pereira等［18］研究了兩種報告基因鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在小鼠的間充質(zhì)干細胞中過表達對細胞鐵的平衡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fth1基因的過表達，在鐵含量供應不足的情況下，影響了鐵的平衡，導致了細胞的表型發(fā)生變化。而本實驗表明，在大鼠間充質(zhì)干細胞中過表達Fth1，正常培養(yǎng)條件下對于細胞的形態(tài)、活力及生長增殖均無顯著影響。至于過表達的Fth1在RMSC中的聚鐵能力以及所聚集的鐵離子對細胞的影響，還需要進一步的研究。雖然鐵蛋白作為內(nèi)源性報告基因具有不可比擬的優(yōu)勢，但是轉(zhuǎn)染細胞后，對細胞的生物學特性如BMSC的成骨、成軟骨、成脂誘導分化情況的影響，都還需要進行考慮。此外，利用MRI對動物體內(nèi)成像顯示的條件也需做更多的探索，這些都為以后采用SWI取代傳統(tǒng)的T2*WI 進行在體標記干細胞的示蹤研究，以期提高標記干細胞檢出的敏感性和進行定量分析提供了技術(shù)條件和奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究使用慢病毒感染系統(tǒng)，構(gòu)建了含有GFP標簽的Fth1基因表達載體，并在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中成功表達了核磁報告基因Fth1；明確了Fth1基因轉(zhuǎn)染BMSC時不影響細胞的形態(tài)和正常增殖，完全可以用于后續(xù)細胞分化及細胞移植研究。

［1］ Cen P, Chen J, Hu C, et al. Noninvasive in-vivo tracing and imaging of transplanted stem cells for liver regeneration［J］. Stem Cell Research & Therapy, 2016, 7（1）：143.

［2］ Ebert SN, Taylor DG, Nguyen HL, et al. Noninvasive tracking of cardiac embryonic stem cells in vivo using magnetic resonance imaging techniques［J］. Stem Cells, 2007, 25（11）：2936-2944.

［3］ Massoud TF, Gambhir SS. Molecular imaging in living subjects：seeing fundamental biological processes in a new light［J］. Genes & Development, 2003, 17（5）：545-580.

［4］ Zhu J, Zhou L, XingWu F. Tracking neural stem cells in patients with brain trauma［J］. The New England Journal of Medicine, 2006, 355（22）：2376-2378.

［5］ 韓昊君, 韓鴻賓, 孫曉梅, 等. 磁共振成像技術(shù)在郁金香花芽分化活體監(jiān)測上的應用研究［J］. 核農(nóng)學報, 2009, 23（2）：248-252.

［6］ Kim SJ, Lewis B, Steiner MS, et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles for direct labeling of stem cells and in vivo MRI tracking［J］. Contrast Media & Molecular Imaging, 2016, 11（1）：55-64.

［7］ Korchinski DJ, Taha M, Yang R, et al. Iron oxide as an MRI contrast agent for cell tracking［J］. Magnetic Resonance Insights, 2015, 8（1）：15-29.

［8］ Zheng B, von See MP, Yu E, et al. Quantitative magnetic particle imaging monitors the transplantation, biodistribution, and clearance of stem cells in vivo［J］. Theranostics, 2016, 6（3）：291-301.

［9］ Cohen B, Dafni H, Meir G, et al. Ferritin as an endogenous MRI reporter for noninvasive imaging of gene expression in C6 glioma tumors［J］. Neoplasia, 2005, 7（2）：109-117.

［10］ Matsumoto Y, Chen R, Anikeeva P, et al. Engineering intracellular biomineralization and biosensing by a magnetic protein［J］. Nature Communications, 2015, 6：8721-8731.

［11］ Yang C, Tian R, Liu T, et al. MRI reporter genes for noninvasive molecular imaging［J］. Molecules, 2016, 21（5）：1-16.

［12］ Yang Y, Gong MF, Yang H, et al. MR molecular imaging of tumours using ferritin heavy chain reporter gene expression mediated by the hTERT promoter［J］. European Radiology, 2016, 26（11）：4089-4097.

［13］ Ziv K, Meir G, Harmelin A, et al. Ferritin as a reporter gene for MRI：chronic liver over expression of H-ferritin during dietary iron supplementation and aging［J］. NMR in Biomedicine, 2010, 23（5）：523-531.

［14］ Arosio P, Ingrassia R, Cavadini P. Ferritins：A family of molecules for iron storage, antioxidation and more［J］. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）- General Subjects, 2009, 1790（7）：589-599.

［15］ Chasteen ND, Harrison PM. Mineralization in ferritin：an efficient means of iron storage［J］. Journal of Structural Biology, 1999, 126（3）：182-194.

［16］ 賀小婭, 蔡金華, 勇秦, 等. 磁共振報告基因 FTH1 慢病毒載體構(gòu)建及其在人神經(jīng)母細胞瘤細胞中的表達［J］. 第三軍醫(yī)大學學報, 2014, 36（23）：2338-2342.

［17］ 南翔. GFP/Ferritin雙標基因的磁共振成像［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學, 2012.

［18］ Pereira SM, Moss D, Williams SR, et al. Overexpression of the MRI reporter genes ferritin and transferrin receptor affect iron homeostasis and produce limited contrast in mesenchymal stem cells［J］. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16（7）：15481-15496.

［19］ Casiraghi F, Perico N, Cortinovis M, et al. Mesenchymal stromal cells in renal transplantation：opportunities and challenges［J］. Nature Reviews. Nephrology, 2016, 12（4）：241-253.

［20］ Wyatt RJ, Julian BA. IgA nephropathy［J］. The New England Journal of Medicine, 2013, 368（25）：2402-2414.

［21］ 陳香美, 謝院生. 重視延緩IgA 腎病進展的基礎(chǔ)和臨床研究［J］. 中華腎臟病雜志, 2004, 20（4）：235-254.

［22］ Herrera M, Mirotsou M. Stem cells：potential and challenges for kidney repair［J］. American Journal of Physiology. Renal Physiology, 2014, 306（1）：12-23.

［23］ Qian H, Yang H, Xu W, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells ameliorate rat acute renal failure by differentiation into renal tubular epithelial-like cells［J］. International Journal of Molecular Medicine, 2008, 22（3）：325-332.

［24］ Aung W, Hasegawa S, Koshikawa-Yano M, et al. Visualization of in vivo electroporation-mediated transgene expression in experimental tumors by optical and magnetic resonance imaging［J］. Gene Therapy, 2009, 16（7）：830-839.

［25］ Choi SH, Cho HR, Kim HS, et al. Imaging and quantification of metastatic melanoma cells in lymph nodes with a ferritin MR reporter in living mice［J］. NMR in Biomedicine, 2012, 25（5）：737-745.

［26］ Feng Y, Liu Q, Zhu J, et al. Efficiency of ferritin as an MRI reporter gene in NPC cells is enhanced by iron supplementation［J］. Journal of Biomedicine & Biotechnology, 2011, 2012：268-281.

［27］ Iordanova B, Hitchens TK, Robison CS, et al. Engineered mitochondrial ferritin as a magnetic resonance imaging reporter in mouse olfactory epithelium［J］. PLoS One, 2013, 8（8）：e72720.

［28］ Kim HS, Cho HR, Choi SH, et al. In vivo imaging of tumor transduced with bimodal lentiviral vector encoding human ferritin and green fluorescent protein on a 1. 5T clinical magnetic resonance scanner［J］. Cancer Research, 2010, 70（18）：7315-7324.

（責任編輯 馬鑫）

Cloning of Ferritin Gene Fth1 and Its Expression in the Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells of Rat

LIU Wei1ZHU Xiu-liang2LI Qing-hai2
（1. Institute of Plant Protection and Microbiology，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021；2. Department of Radiology，the Second Affiliated Hospital，College of Medical Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310009）

Aims are to construct a lentivirus encoding rat ferritin heavy chain 1（Fth1）and to detect its expression in rat bone mesenchymal stem cells（RMSCs）. The rat Fth1 gene was amplified by PCR and cloned into the lentivirus expression vector pLenti-GFP-C. The lentivirus carrying pLenti-GFP-C-Fth1 or empty vector was then packaged in HEK 293T cells，by which the RMSCs were infected. GFP expression was observed under a fluorescence microscope. Fth1 expression was detected by Western blot. WST-1 reagent was used to analyze the proliferation of infected cells（RMSC-Fth1）and empty vector（RMSC-GFP）. Results of DNA sequencing showed that the pLenti-GFP-CFth1 lentivirus expression vector was successfully constructed. After RMSCs were infected by the packaged lentivirus，GFP was observed under a fluorescence microscope，indicating the infection was achieved. A specific band of Fth1 in the lysate of Fth1-lentivirus infected cells（RMSCFth1）was detected by Western blot. Cell proliferation assay showed that the growth of RMSC was not affected by overexpressing Fth1 compared with RMSC-GFP. As conclusion，the recombinant lentivirus vector carrying rat Fth1 gene was successfully constructed，infected RMSC as expected，and expressed FTH1 protein even without significant impacts on the cell proliferation.

Fth1；MRI reporter；lentivirus vector；rat bone mesenchymal stem cell

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.026

2016-10-11

浙江省自然科學基金項目（LY15H180004），浙江省公益項目（2015C32020）

劉偉，男，博士，研究方向：分子生物學；E-mail：biolwei@sina.com

李清海，男，博士，研究方向：分子影像學；E-mail：liqinghai1978@163.com