UPLC-MS/MS法測定人血漿中羅匹尼羅的濃度及其藥動學研究Δ

黃晨蓉，許青青，繆麗燕（1.蘇州大學附屬第一醫(yī)院臨床藥理室，江蘇蘇州 15006；.蘇州大學藥學院，江蘇蘇州 15000）

UPLC-MS/MS法測定人血漿中羅匹尼羅的濃度及其藥動學研究Δ

黃晨蓉1，2＊，許青青2，繆麗燕1#（1.蘇州大學附屬第一醫(yī)院臨床藥理室，江蘇蘇州 215006；2.蘇州大學藥學院，江蘇蘇州 215000）

目的：建立測定人血漿中羅匹尼羅濃度的方法，并用于藥動學研究。方法：血漿樣品經(jīng)乙腈沉淀后，以阿替洛爾為內(nèi)標，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。色譜柱為WatersACQUITY UPLC BEHAmide，流動相為水（含10 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸）-乙腈（85∶15，V/V），流速為0.3 mL/min，柱溫為40℃，進樣量為5 μL。采用電噴霧離子源，以多反應監(jiān)測方式進行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 261.2→114.1（羅匹尼羅）和m/z 267.2→145.0（內(nèi)標）。選擇8例健康受試者，男、女各半，單次給予鹽酸羅匹尼羅片1.0 mg后，采用該法測定給藥前后羅匹尼羅的血藥濃度，采用WinNonlin 6.3軟件計算其藥動學參數(shù)。結(jié)果：羅匹尼羅血藥濃度在0.02～2 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.997 3），批內(nèi)、批間RSD＜10%，準確度為95.2%～99.7%，提取回收率為68.5%～79.9%，基質(zhì)效應和稀釋效應均不影響其血藥濃度的測定。8例健康受試者口服鹽酸羅匹尼羅片1.0 mg后，cmax為（2.1±0.5）ng/mL，tmax為（1.0±0.5）h，t1/2為（4.7±1.5）h，AUC0-36h為（14.7±6.0）ng·h/mL，AUC0-∞為（15.1±6.1）ng·h/mL；不同性別受試者主要藥動學參數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：該方法操作簡便、靈敏度高、分析時間短，適用于人血漿中羅匹尼羅的濃度測定及藥動學研究。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；羅匹尼羅；血藥濃度；藥動學

鹽酸羅匹尼羅（Ropinirole hydrochloride）為非麥角堿類多巴胺受體激動藥，于1996年在英國上市，現(xiàn)已在多個國家臨床應用于治療帕金森病（Parkinson disease，PD）[1]。與傳統(tǒng)多巴胺受體激動藥相比，鹽酸羅匹尼羅避免了因麥角結(jié)構(gòu)引起的嚴重纖維化不良反應；同時，由于其與受體的高度選擇性，還可降低左旋多巴所致運動障礙的發(fā)生率；此外，鹽酸羅匹尼羅還具有神經(jīng)保護作用[2]。臨床研究顯示，鹽酸羅匹尼羅不論是單藥治療早期PD還是聯(lián)合左旋多巴治療晚期PD，均表現(xiàn)出較好的療效；且PD患者早期接受鹽酸羅匹尼羅的單藥治療還可推遲聯(lián)用左旋多巴的時間或減少其使用劑量，延遲PD并發(fā)癥的發(fā)生，長期使用安全、有效，且耐受性較好[3-4]。目前，國內(nèi)外研究多采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定人血漿中羅匹尼羅的濃度，以乙酸乙酯、甲基叔丁醚等為溶劑，采用液-液萃取法處理血漿樣品，操作煩瑣且耗時[5-11]。故本試驗在此基礎(chǔ)上，建立了一種快速、靈敏的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，并將其應用于臨床藥動學研究，為鹽酸羅匹尼羅Ⅱ期臨床試驗方案的制訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC儀、Xevo-TQS三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；XS105DU型分析天平（美國Mettler公司）；Allegra 64R型高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；Milli-Q型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸羅匹尼羅對照品（美國Pharmacopeia公司，批號：F0J036，純度：99.5%）；阿替洛爾對照品（內(nèi)標，中國食品藥品檢定研究院，批號：100117-201105，純度：99.8%）；鹽酸羅匹尼羅片（浙江華海藥業(yè)股份有限公司，批號：11813001，規(guī)格：1.0 mg/片）；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：水（含10 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸）-乙腈（85∶15，V/V）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：5 μL。

采用電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI），以多反應監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描，正離子方式檢測。毛細管電壓：1.34 kV；錐孔電壓：70 V；碰撞電壓：20 eV；脫溶劑溫度：500℃；脫溶劑氣流速：1 000 L/h；錐孔氣流速：150 L/h。用于定量分析的離子對分別為：m/z 261.2→114.1（羅匹尼羅）和m/z 267.2→145.0（內(nèi)標）。

2.2 溶液的制備

精密稱取鹽酸羅匹尼羅對照品11.40 mg（相當于羅匹尼羅9.998 mg），置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得羅匹尼羅質(zhì)量濃度為1 mg/mL的貯備液，置于4℃冰箱中保存。用50%乙腈稀釋成相應質(zhì)量濃度的標準工作液，備用。

另精密稱取內(nèi)標對照品10.26 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度為1.026 mg/mL的內(nèi)標貯備液；取上述內(nèi)標貯備液適量，用50%乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為500 ng/mL的內(nèi)標溶液，置于4℃冰箱中保存，備用。

2.3 血漿樣品處理

精密吸取空白血漿0.1 mL，加入50%乙腈10 μL，加入內(nèi)標溶液（500 ng/mL）10 μL，加入乙腈0.1 mL，渦旋振蕩1 min，在4℃下，以19 722×g離心10 min，取上清液100 μL至進樣瓶中，進樣分析。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性考察 在“2.1”項條件下，內(nèi)源性雜質(zhì)對待測物無干擾，羅匹尼羅和內(nèi)標的峰形較好，分離完全，保留時間分別約為1.2和1.0 min。典型色譜圖見圖1。

圖1 典型MRM色譜圖Fig 1 Typical MRM chromatograms

2.4.2 標準曲線的繪制與定量下限的考察 精密吸取空白血漿、羅匹尼羅標準工作液各適量，配制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣測定，記錄色譜圖。以待測物質(zhì)量濃度（c）為橫坐標、待測物與內(nèi)標的峰面積比值（f）為縱坐標，采用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重系數(shù)w＝1/c2）進行線性回歸，得回歸方程為f＝31.239 7c+50.890 5（r＝0.997 3）。結(jié)果顯示，羅匹尼羅的血藥濃度在0.02～2 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其定量下限為0.02 ng/mL（批內(nèi)RSD＜20%）。

2.4.3 精密度與準確度試驗 分別配制羅匹尼羅低、中、高質(zhì)量濃度（0.05、0.2、1.5 ng/mL，下同）的質(zhì)控（QC）樣品，按“2.3”項下方法處理，每質(zhì)量濃度取6樣本分析，連續(xù)測定3批，根據(jù)當批標準曲線計算各樣品的測得質(zhì)量濃度，考察方法的精密度與準確度，結(jié)果見表1。

表1 精密度與準確度試驗結(jié)果（）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（）

表1 精密度與準確度試驗結(jié)果（）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（）

理論質(zhì)量濃度，ng/mL準確度，% 0.05 0.2 1.5批內(nèi)精密度（n＝6）測得質(zhì)量濃度，ng/mL 0.046±0.002 0.185±0.013 1.425±0.916 RSD，% 5.3 7.2 6.4批間精密度（n＝3）測得質(zhì)量濃度，ng/mL 0.050±0.005 0.190±0.013 1.467±0.986 RSD，% 9.1 6.7 6.7 99.7 95.2 97.8

由表1可見，各質(zhì)量濃度QC樣品的批內(nèi)RSD分別為5.3%、7.2%和6.4%，批間RSD分別為9.1%、6.7%和6.7%，準確度為95.2%～99.7%，精密度與準確度均符合相關(guān)指導原則的基本要求[12]。

2.4.4 提取回收率試驗 分別配制羅匹尼羅低、中、高質(zhì)量濃度的QC樣品各6份，按“2.3”項下方法處理后，進樣測定，得相應色譜峰峰面積（A1）；取空白血漿適量，按“2.3”項下方法處理后，加入相應質(zhì)量濃度的羅匹尼羅標準工作液，使最終質(zhì)量濃度與前者相對應，進樣測定，得相應色譜峰峰面積（A2）。提取回收率（%）＝A1/A2× 100%。結(jié)果顯示，各質(zhì)量濃度QC樣品羅匹尼羅的提取回收率分別為68.5%、77.7%和79.9%；內(nèi)標的提取回收率為68.3%，RSD＜15%（n＝6）。

2.4.5 基質(zhì)效應 取空白血漿適量，按“2.3”項下方法處理后，加入相應質(zhì)量濃度的羅匹尼羅標準工作液和內(nèi)標溶液適量，進樣測定，得相應色譜峰峰面積（C）；另取同體積相應質(zhì)量濃度的標準工作液和內(nèi)標溶液，以氮氣流吹干，殘渣用流動相復溶，使最終質(zhì)量濃度與前者相對應，進樣測定，得相應色譜峰峰面積（B）。基質(zhì)效應（%）＝C/B×100%。結(jié)果顯示，各質(zhì)量濃度QC樣品羅匹尼羅的基質(zhì)效應分別為81.1%、92.1%和94.3%，內(nèi)標的基質(zhì)效應為93.0%，表明基質(zhì)效應不影響羅匹尼羅血藥濃度的測定[12]。

2.4.6 稀釋效應 配制質(zhì)量濃度為3 ng/mL的血漿樣品共6份，用空白血漿以體積比1∶1的比例稀釋后，按“2.3”項下方法處理，進樣測定，考察各樣品的稀釋可靠性，計算各樣品測得質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的偏差。結(jié)果顯示，各樣品的偏差為7.2%～12.7%，符合相關(guān)指導原則基本要求[12]。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗 配制羅匹尼羅低、中、高質(zhì)量濃度的QC樣品，分別于室溫放置6 h、經(jīng)歷3次凍融（每次冷凍保存的時間＞12 h）、－80℃放置45 d后，按“2.3”項下方法處理，進樣測定，考察各樣品的穩(wěn)定性；同時考察各樣品按“2.3”項下方法處理后于自動進樣器（10℃）中放置24 h的穩(wěn)定性。計算各樣品的測得質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的偏差。結(jié)果顯示，各樣品的偏差為－9.8%～11.7%，RSD＜15%，表明其在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.4.8 質(zhì)量控制 分別配制羅匹尼羅低、中、高質(zhì)量濃度的QC樣品，與每個分析批的待測樣品同時測定，計算各QC樣品測得質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的偏差。結(jié)果顯示，各批QC樣品測定結(jié)果的偏差均＜15%，符合生物樣品定量分析的基本要求[12]。

2.5 藥動學研究

2.5.1 研究對象 選擇8例健康受試者，男性、女性各4例，平均年齡（25.5±1.7）歲，平均身高（1.7±0.1）m，平均體質(zhì)量（60.3±7.4）kg，平均體質(zhì)量指數(shù)（21.4±1.9）kg/m2。受試者試驗前心電圖、血壓、血尿常規(guī)、肝腎功能檢查均正常，無藥物過敏史，無慢性疾病史；試驗前1個月及試驗期間未使用過其他藥物。受試期間統(tǒng)一清淡飲食，忌煙、酒及含藥物、咖啡因的飲料，不食用影響肝藥酶的水果及飲料。本試驗方案經(jīng)蘇州大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，受試者均知情同意并簽署知情同意書。

2.5.2 單劑量藥動學研究 本試驗采用開放、單中心、單劑量臨床試驗設(shè)計，給藥劑量為1.0 mg。受試者隔夜禁食，于次日晨起空腹口服鹽酸羅匹尼羅片1.0 mg，以200 mL溫水送服，給藥后2 h內(nèi)不飲水，4 h后統(tǒng)一進食標準餐。分別于給藥前及給藥后0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0和36.0 h采集前臂靜脈血4 mL，置肝素抗凝管中，以2 352×g離心10 min，分離血漿，置于－80℃冰箱中冷凍保存，待測。

采用UPLC-MS/MS法測定不同時間點受試者體內(nèi)羅匹尼羅的血藥濃度。若血藥濃度超過了線性范圍上限，則將樣品用空白血漿以體積比1∶1的比例稀釋，按“2.3”項下方法處理后，重新測定。采用WinNonlin 6.3軟件計算藥動學參數(shù)，采用SPSS 16.0軟件處理所得數(shù)據(jù)，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義

8例健康受試者單劑量口服鹽酸羅匹尼羅片后的平均藥-時曲線見圖2，主要藥動學參數(shù)見表2。

圖2 8例健康受試者單劑量口服鹽酸羅匹尼羅片后的平均藥-時曲線（n＝8）Fig 2 Mean plasma concentration-time curve in 8 healthy volunteers after a single oral dose of Ropinirole hydrochloride tablets（n＝8）

表2 主要藥動學參數(shù)（）Tab 2 Main pharmacokinetic parameters（）

表2 主要藥動學參數(shù)（）Tab 2 Main pharmacokinetic parameters（）

參數(shù)cmax，ng/mL tmax，h t1/2，h AUC0-36h，ng·h/mL AUC0-∞，ng·h/mL男性（n＝4）2.0±0.5 1.1±0.7 4.5±0.7 15.1±7.0 15.3±7.1女性（n＝4）2.2±0.5 1.0±0.4 5.0±2.2 14.3±5.9 14.9±6.0合計（n＝8）2.1±0.5 1.0±0.5 4.7±1.5 14.7±6.0 15.1±6.1

由表2可見，男性受試者和女性受試者主要藥動學參數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示性別對其主要藥動學參數(shù)無明顯影響。

8例受試者中，有7例受試者發(fā)生藥品不良事件，其中惡心6例、頭暈4例、嘔吐1例、多汗2例，均發(fā)生在給藥后40～60 min，其中1例受試者在給藥后142 min時再次出現(xiàn)頭暈，并在70 min內(nèi)自行痊愈。1例受試者出現(xiàn)尿白細胞升高，經(jīng)醫(yī)師診斷為異常，具有臨床意義，6 d后恢復正常。未見其他嚴重不良事件發(fā)生。

3 討論

在色譜條件優(yōu)化過程中，筆者考察了Waters ACQUITY UPLC BEHAmide（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）及不同規(guī)格的Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm和100 mm×2.1 mm，1.7 μm）等色譜柱。結(jié)果顯示，相比于BEH C18，BEH Amide可得到更好的色譜峰形。在選擇流動相時，筆者考察了0.1%甲酸水溶液、10 mmol/L乙酸銨水溶液和水（含10 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸）對檢測的影響。結(jié)果顯示，后者可得到較好的峰形，且響應值最大，故選擇其作為水相。

在質(zhì)譜條件優(yōu)化過程中，對羅匹尼羅母離子和子離子進行掃描，發(fā)現(xiàn)正離子模式響應強，故采用正離子檢測模式。在質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化過程中，根據(jù)信號強度將羅匹尼羅的定量離子對確定為m/z 261.2→114.1，錐孔電壓和碰撞電壓分別確定為70 V和20 eV。在相同檢測條件下，篩選了多種內(nèi)標物質(zhì)（如奧美拉唑、氟氯西林、阿替洛爾等），根據(jù)信號強度及與羅匹尼羅色譜峰的分離度，最終確定內(nèi)標為阿替洛爾，其定量離子對為m/z 267.2→145.0，錐孔電壓為70 V，碰撞電壓為20 eV。

在血漿樣品處理方法的篩選中，筆者嘗試了蛋白沉淀法和液-液萃取法，發(fā)現(xiàn)蛋白沉淀法可有效去除蛋白；而以乙酸乙酯、甲基叔丁醚等為溶劑的液-液萃取法[8-9]，雖然也能有效去除蛋白，但是操作煩瑣且耗時，不利于大批量樣本處理。因此，本試驗最終選擇簡單易行的蛋白沉淀法，與文獻報道的方法[5-11]比較，該法重復性良好，內(nèi)源性物質(zhì)干擾較少，可滿足生物樣本快速批量檢測的需求。

對本試驗建立的UPLC-MS/MS法進行方法學考察，結(jié)果顯示，在“2.1”項條件下，羅匹尼羅和內(nèi)標的保留時間分別約為1.2和1.0 min，峰形良好，不受血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾；羅匹尼羅的血藥濃度在0.02～2 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，批內(nèi)、批間RSD＜10%；提取回收率、基質(zhì)效應和稀釋效應等均符合生物樣品定量分析的基本要求[12]，且穩(wěn)定性良好。

羅匹尼羅是一種非麥角堿類的多巴胺受體激動藥，目前國外臨床研究多在患者中開展，且根據(jù)藥物的不用劑型設(shè)計不同的給藥方案。藥品說明書指出，該藥普通片劑成人初始劑量為0.25 mg，tid，每周向上調(diào)整，即第1周劑量為0.25 mg，tid；第2周劑量為0.5 mg，tid；第3周劑量為0.75 mg，tid；第4周劑量為1.0 mg，tid，劑量最高可增加至3.0 mg，tid。常用維持日劑量為3～9 mg，最大日劑量為24 mg。而以健康受試者為研究對象的臨床試驗，國內(nèi)已有文獻報道[13]，其劑量低于臨床常用劑量，為單次口服1.0 mg，未見相關(guān)不良事件。因此，本試驗將低于臨床常用劑量且文獻報道安全的1.0 mg設(shè)定為給藥劑量，開展單劑量、單中心藥動學試驗。結(jié)果顯示，8例健康受試者（男、女各半）單次口服鹽酸羅匹尼羅1.0 mg后的主要藥動學參數(shù)為cmax（2.1±0.5）ng/mL、t1/2（4.7±1.5）h、tmax（1.0±0.5）h，且性別對主要藥動學參數(shù)無明顯影響（P＞0.05）。試驗過程中，有7例受試者發(fā)生藥品不良事件，包括惡心、頭暈、嘔吐、多汗、尿白細胞升高等，醫(yī)師綜合判斷可能與藥物相關(guān)，臨床應予以重視。

本試驗僅初步考察了單次口服鹽酸羅匹尼羅片后在健康人體內(nèi)的藥動學特性，在后續(xù)試驗中，本課題組將進一步開展以PD患者為研究對象的多劑量、多中心藥動學研究，以期為鹽酸羅匹尼羅片后續(xù)臨床試驗給藥方案的制訂提供理論依據(jù)。

（本研究經(jīng)原國家食品藥品監(jiān)督管理局批準，臨床試驗批件號：2012L00005）

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Determination of Ropinirole in Human Plasma by UPLC-MS/MS and Its Pharmacokinetic Study

HUANG Chenrong1，2，XU Qingqing2，MIAO Liyan1（1.Dept.of Clinical Pharmacology，the First Affiliated Hospital of Soochow University，Jiangsu Suzhou 215006，China；2.College of Pharmacy，Soochow University，Jiangsu Suzhou 215000，China）

UPLC-MS/MS；Ropinirole；Plasma concentration；Pharmacokinetics

R945

A

1001-0408（2017）02-0177-05

2016-05-20

2016-11-01）

（編輯：張元媛）

國家自然科學基金青年科學基金項目（No.81503159）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：臨床藥學。電話：0512-67780467。E-mail：chrishuangcr@163.com

#通信作者：主任藥師，教授，博士生導師，博士。研究方向：臨床藥學。電話：0512-67780467。E-mail：miaolysuzhou@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.02.09

ABSTRACTOBJECTIVE：To develop a method for the determination of ropinirole in human plasma and pharmacokinetic study. METHODS：After precipitated with acetonitrile，using atenolol as internal standard，plasma sample was determined by UPLC-MS/ MS.The separation was performed on Waters ACQUITY UPLC BEH Amide column with mobile phase consisted of water（containing 10 mmol/L ammonium acetate and 0.1%formic acid）-acetonitrile（85∶15，V/V）at flow rate of 0.3 mL/min.The column temperature was set at 40℃，and sample size was 5 μL.The analyses were carried out by ESI under MRM model in positive mode.The mass transition ion-pairs were as follows：m/z 261.2→114.1（ropinirole）and m/z 267.2→145.0（internal standard）.8 healthy volunteers were selected with a gender ratio of half to half，and were given Ropinirole hydrochloride tablets 1.0 mg.Plasma concentrations of ropinirole were determined before and after medication.The pharmacokinetic parameters were calculated by WinNonlin 6.3 software.RESULTS：The linear range of ropinirole were 0.02-2 ng/mL（r＝0.997 3）with RSDs of inter-batch and intra-batch＜10%；accuracy ranged 95.2%-99.7%，and extraction recoveries ranged 68.5%-79.9%.Both matrix effects and dilution effects didn’t influence the determination of plasma concentration.The main pharmacokinetic parameters of ropinirole in 8 healthy volunteers after oral administration of Ropinirole hyolrocholride tablets 1.0 mg were as follows：cmaxwas（2.1±0.5）ng/mL，tmaxwas（1.0±0.5）h，t1/2was（4.7±1.5）h，AUC0-36hwas（14.7±6.0）ng·h/mL，AUC0-∞was（15.1±6.1）ng·h/mL.There was no statistical significance in main pharmacokinetic parameters between different gender（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The method is simple，sensitive and less time-consuming.It is suitable for the plasma concentration determination and pharmacokinetic study of ropinirole in human.