紅椿SRAP反應體系優化及引物篩選

李 培,闕青敏,王 芳,李俊成,朱 芹,廖柏勇 ,陳曉陽*

(1.華南農業大學林學與風景園林學院 廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室,廣東 廣州 510642；2.嘉應學院, 廣東 梅州 514015)

紅椿SRAP反應體系優化及引物篩選

李 培1,闕青敏1,王 芳1,李俊成1,朱 芹2,廖柏勇1,陳曉陽1*

(1.華南農業大學林學與風景園林學院 廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室,廣東 廣州 510642；2.嘉應學院, 廣東 梅州 514015)

[目的]優化相關序列擴增多態性(SRAP)體系內的不同組分，建立適用于紅椿SRAP分子標記的反應體系，并進一步從SRAP引物組合中篩選出穩定、多態性好的引物組合，為紅椿遺傳多樣性研究奠定試驗基礎。[方法]針對SRAP-PCR反應體系中5個因素各設置8個水平，先利用單因素試驗確定濃度梯度，后在確定的梯度范圍內選定4個水平，按照正交試驗L16(45)進行優化，結合正交直觀分析法和新復極差法對各因素進行優化篩選。[結果]確定最優體系為總體系25 μL，模板DNA 25 ng，上下游引物各0.3 μmol·L-1，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+2.5 mmol·L-1，dNTP 0.3 mmol·L-1。利用穩定的SRAP-PCR體系，從1 505對SRAP引物組合中篩選出30對優質引物組合。[結論]通過不同種源紅椿基因組DNA的重復驗證，獲得了穩定清晰、多態性較強的擴增條帶，表明所確定的最優體系穩定可靠，適用性較強，可用于不同種源紅椿遺傳多樣性研究的后續實驗。

紅椿；SRAP分子標記；反應體系；引物篩選

Optimization and Primers Selection of SRAP-PCR System in

在林木遺傳育種研究中，分子標記是使用最廣泛的一種遺傳標記類型，因其不受發育時期及環境或季節性的制約，被廣泛地被運用于遺傳多樣性、分子遺傳育種等研究中[1-2]。SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)即相關序列擴增多態性是一種新型分子標記技術，其基礎來源于PCR擴增反應，通過對基因的開放閱讀框(ORFs)中相對保守的外顯子區域及變異豐富的內含子及啟動子區域進行擴增，獲得物種或個體之間的遺傳差異與分化[3-4]。該分子標記采用的是雙引物設計，因其簡便、高效、產率高等特點，使該標記成功地應用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構建等分子研究方面的分析[5-8]。

紅椿(ToonaciliataRoem)，又名紅楝子，是楝科(Meliaceae)香椿屬(Toona)速生植物。該樹種材質優良，紋理優美，由于其木材呈現紅色，堅韌耐腐，常作為高檔家具用材出口國際，開發潛力巨大，被譽為“中國桃花心木”[9-10]。由于環境的變化、天然更新能力較差、過度的人為破壞及需求量的不斷增加，紅椿數量在持續減少，已成為珍貴的瀕危樹種，被列為國家Ⅱ級重點保護野生植物。紅椿在印度、老撾、緬甸、泰國、巴基斯坦至澳大利亞東海岸也有天然分布[11]，并在世界多地進行引種[12]。在我國集中分布在華南、華中、華東及西南地區，呈零星或散點分布[13]。一個物種生存或者適應環境，獲得發展和進化的依靠前提是其自身所具有的遺傳多樣性[14]。研究紅椿的遺傳多樣性對其選擇育種、遺傳資源的保護具有重要的理論和實踐意義。

本研究采用單因素試驗及正交試驗對SRAP-PCR體系中的5大因素，包括模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+及dNTP進行優化，旨在確定最優的穩定反應體系，并從隨機引物組合中篩選出能夠擴增穩定、清晰且含有多態性條帶的最優引物組合，為進一步開展紅椿遺傳多樣性研究、種質資源鑒定及遺傳育種奠定基礎，提供技術支持。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

以不同種源紅椿母樹葉片作為試材，于采集地收集并利用硅膠迅速干燥，置于實驗室-80℃冰箱用于后續DNA提取。用于引物篩選的種源包括云南永仁、貴州望謨、四川會東、廣東樂昌、江西宜豐、安徽黃山、福建南平及湖南城步。種源信息見表1。

表1 紅椿SRAP-PCR 體系優化試驗材料Table 1 Experimental material of T. ciliata for optimizing SRAP-PCR system

1.2 試驗方法

1.2.1 紅椿基因組DNA的提取 取100 mg干燥葉片做樣品，首先利用CTAB free 溶液(0.2 mmol·L-1Tris-HCl，0.25 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol·L-1EDTA，pH=8.0)對樣品進行低溫洗滌，去除雜質[15-16]。后采用EZNA?High-Performance DNA Mini Ki 試劑盒提取紅椿基因組DNA。使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳及超微量紫外分光光度計(Thermo NanoDrop 1000)進行檢測。稀釋至50 ng·μL-1，樣品置于-20℃下保存備用。

1.2.2 PCR反應單因素濃度梯度確定 首先對反應體系的5大因素，即，模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+及dNTP進行單因素試驗。每個影響因素分別設置8個梯度。模板DNA濃度包括0、25 、50、60、70、80、90和100 ng；引物濃度包括0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 μmol·L-1；TaqDNA聚合酶包括0、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75和2 U；Mg2+濃度包括0、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 mmol·L-1；dNTP濃度梯度包括0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35和0.4 mmol·L-1。

1.2.3 反應體系正交試驗 進行單因素試驗確定5大因素濃度范圍后，在其范圍內選定4個水平濃度梯度(表2)，采用L16(45)正交試驗設計(表3)，共16個處理，每個處理選用不同種源DNA進行2次重復。根據所擴增出的電泳條帶的多少、清晰度及背景顏色，對16個處理進行評分[17-18]。最優的得16分，最差的得1分，兩次重復取平均分為該處理水平擴增結果的最終得分。后計算每個因素在不同水平下的平均得分，進行統計分析后獲得極差。在某水平下某因素所參與的擴增反應所得到的擴增結果評分的總和用K值表示；R表示為極差，即，某試驗因素在不同處理水平下所得到評分的最大平均值與最小平均值之差[19]。紅椿SRAP分子標記反應總體系選用為25 μL(均含有2.5 μL 10×Buffer，用重蒸水補齊體系)，引物選用M22(TGA GTA CAA ACC GG GTC)E27(GAC TGC GTA CGA ATT CCA)。

表2 正交試驗各因子水平設計Table 2 The design of factors and the levels for orthogonal experimental

表3 SRAP-PCR 正交試驗設計[L16(45)]Table 3 L16(45)orthogonal experimental of SRAP-PCR

1.2.4 SRAP-PCR 擴增 SRAP分子標記反應程序選用為94℃ 5 min；5個循環(94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min)；35個循環(94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min)；72℃延伸10 min；4℃保存。產物在2%的瓊脂糖凝膠上進行分離，自動凝膠成像儀上照相保存，用于體系優化因素確定。

1.2.5 引物篩選 在確定最優穩定體系后，根據SRAP分子標記引物組合通用性的特點，查找其在各物種研究中所發表的引物序列[20-26]，包括43個正向引物與35個反向引物，隨機組合，共計1 505對引物組合對8份來源不同，地理距離差別較大的紅椿基因組DNA進行引物篩選。PCR擴增產物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進行分離并通過銀染染色檢測。保鮮膜封膠，照相或制干膠保存。

采用遺傳多樣性信息含量(PIC)評價試驗所選定引物組合評估能力。

PICi= 2fi(1 -fi)

式中，PICi為標記i的遺傳多樣性信息含量，fi為標記i出現條帶的頻率， 1-fi是缺失條帶的頻率，一對引物的PIC為各個條帶的平均值[27]。

2 結果與分析

2.1 DNA 檢測

注：M: DL2000 markerNote: M: DL2000 marker圖1 紅椿DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose electrophresis of genomic DNA from T. ciliata

2.2 單因素試驗分析

注：圖中A、B、C、D、E分別表示模板濃度(116 DNA含量分別為0、25 、50、60、70、80、90和100 ng)、引物濃度(116 引物濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 μmol·L-1)、Taq DNA 酶濃度(116 Taq酶含量分別為0、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75和2 U)、Mg2+濃度(116 Mg2+濃度分別為0、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 mmo·L-1)及dNTP濃度(116 dNTP濃度分別為0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35和0.4 mmol·L-1)，每個梯度兩個不同DNA模板重復。Note: A, B, C, D, E is DNA concentration (116 is 0、25 、50、60、70、80、90 and 100ng, respectively. Repeated twice), primer concentration (116 is 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 and 0.7μmol/L, respectively. Repeated twice), Taq polymerase (116 is 0、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75 and 2 U, respectively. Repeated twice), Mg2+ concentration (116 is 0、1、1.5、2、2.5、3、3.5 and 4 mmol/L, respectively. Repeated twice), dNTP concentration respectively (116 is 0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 and 0.4 mmol/L, respectively. Repeated twice).圖2 因素濃度對SRAP-PCR擴增反應的影響Fig. 2 The effect of factors concentration on SRAP analysis

2.3 正交試驗各因素確定

在單因素試驗所確定的5大因素的濃度范圍內，選定4個水平的濃度梯度，根據L16(45)正交設計對SRAP-PCR進行體系優化。根據電泳結果首先進行直接主觀性觀察(圖3)。按照擴增條帶的質量，包括擴增清晰度、條帶亮度及條帶數目等對各組合進行評分，兩次重復取平均分(表4)。

圖3 SRAP反應體系正交試驗結果(A與B為兩個重復)Fig. 3 Amplified pattern of SRAP-PCR based on orthogonal designs(A and B for two repeated trials)

處理treatment重復1copy1重復2copy2均值mean1676.52151414.531313134141514.55121.56211.579998121212933310111111111616161210101013766.5145551588816444

最優條件及各因素影響力的大小由極差(R值)的大小判斷。R值越大，證明某一因素在不同水平下對反應體系及擴增結果影響越顯著。結果顯示(表5)，在確定的4個水平內，模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+及dNTP 5大因素對擴增影響從大到小依次排列為：Mg2+>TaqDNA聚合酶>引物> dNTP> 模板DNA濃度。

表5 各因素極差分析結果Table 5 The result of range analysis for the factors

各因素的某一水平影響反應體系的情況需要由K值確定，K值越大，因素所處當前水平PCR擴增效果越好。根據表4，選定各因素K值最大值時的濃度作為最優體系：其中模板DNA濃度為25 ng，引物濃度為0.3 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶為1 U、Mg2+濃度為 2.5 mmol·L-1及dNTP 濃度為0.3 mmol·L-1。

2.4 體系穩定性測定及引物篩選

利用以上確定的最優體系進行重復試驗，確定體系的穩定性和適用性。利用8個不同種源的紅椿基因組DNA進行檢測。如圖4所示，該體系擴增條帶清晰可見，并且多態性高。證明所得到的優化SRAP-PCR體系穩定并且可靠，可有效地進行PCR擴增，適用性強，用于區別不同種源紅椿之間的遺傳差異，可用于后續試驗。

注：M：DL2000 Marker，泳道18分別代表廣東樂昌、安徽黃山、貴州望謨、云南永仁、江西宜豐、湖南城步、福建南平和四川會東Note: M: DL2000 marker, 18 is Lechang, Huangshan, Wangmo, Yongren, Yifeng, Chengbu, Nanping, Huidong圖4 優化的SRAP-PCR體系對8份紅椿DNA擴增結果Fig. 4 Amplification results of 8 different T. ciliata DNA with the best SRAP-PCR

根據條帶擴增的多態性及清晰度進行引物組合的確定。最終篩選出30對引物組合(表6)，用于紅椿遺傳多樣性測定及分析。30對引物對紅椿30個種源進行測定評估，各引物組合所擴增出的條帶、多態性條帶、多態位點百分率和每對引物的PIC見表。根據表中多態百分率和PIC值進行判定，引物組合Me35Em32(多態百分率為94.74%)，Me23Em22，Me27Em7，Me31Em24，Me32Em17，Me39Em32和Me43Em19(以上引物組合的PIC值(0.43，排名均為30對引物組合的前三名)可作為紅椿SRAP分子標記的優先骨干引物。

表6 30對SRAP引物的總條帶數、多態性條帶數、 多態性比率及PIC值Table 6 Total number of bands, polymorphic bands, polymorphism and polymorphic information content (PIC) obtained from 30 SRAP primer combinations

相比較瓊脂糖凝膠的分離效果，6%變性聚丙烯酰胺凝膠分離效果更好，銀染染色檢測條帶清晰，分辨率高，更適合紅椿SRAP分子標記的分析和鑒定。

3 討論

SRAP分子標記主要針對基因開放閱讀框(ORFs)的特定區域進行擴增。上游引物長17 bp，主要目標為基因中相對保守的外顯子區域；下游引物長18 bp，富含AT-片段，對多態性較為豐富的內含子和啟動子進行擴增，獨特引物組合會因個體或物種所包含的內含子、啟動子及間隔區間的不同而產生多態性[6]。在反應體系優化過程中，SRAP-PCR會因為不同的反應條件、反應程序及物種差異，會產生不同的擴增結果，體系中每一個因素的變化都會對導致擴增結果偏差[29]。本研究首先利用單因素試驗確定反應體系中5大因素的濃度范圍，以減少盲目性[30]。依據正交試驗設計再次進行多因素多水平綜合檢測，充分發揮了正交試驗的均衡分散、綜合可比的特點，快速有效地明確各因素的組合關系[31]。同時選擇直接觀察方法與新復極差法對擴增反應中各因素的影響作用及各因素最優濃度進行綜合分析評估，削弱或避免了僅僅依靠主觀判斷的誤差[32]。本研究中，兩次正交試驗重復評分差別不明顯，此結果與陳麗君等[33]對苦楝的研究結果一致，證明SRAP-PCR 反應體系相對比較穩定。經新復極差法研究發現，5大因素中Mg2+的極差R最大，說明在體系中Mg2+影響力最大。作為TaqDNA聚合酶的激活劑，Mg2+直接影響擴增過程中的酶活性。若體系中Mg2+濃度過高，會直接導致非特異性擴增的發生，但為了保證正常激活酶活性，濃度不能過少，否則會得到不理想的擴增結果，影響擴增結果的準確性和重復性。在本研究中，Mg2+在體系中具有最重要的作用，后續的試驗中一定要著重注意該因素的一致性。起到次要作用的因素為TaqDNA聚合酶。TaqDNA酶濃度必須在一個合適范圍內才能成功地擴增出特異性片段，濃度少，無法得到準確數量的擴增片段，濃度大，會擴增出多余的非特異性片段。引物的濃度同樣是PCR擴增過程中的重要因素，若出現模板DNA無法與之配對，擴增失敗的結果，則與濃度過低有關；產生非特異性性片段和形成引物二聚體，則可能是引物濃度過高造成的。dNTP是PCR擴增反應的底物，若擴增產率降低或聚合酶滲入則與其有關；模板DNA是擴增反應的基礎，但如果DNA質量較高，適量的濃度一般不會對擴增結果產生過多的影響[34-35]。各物種所含基因的差異及PCR試驗的外在條件，都會直接或間接的影響到擴增結果[18]，因此，不同的物種應具有獨立穩定的反應條件及體系。

在進行引物能力評估時，可依據PIC值對引物進行初步判斷。當PIC > 0.5，表示該引物或引物組合所呈現的多態性最好，貢獻率較高，可以最大程度的反應遺傳多樣性。當0.25 < PIC < 0.5，或者PIC值< 0.25時，則分別說明該引物擴增得到的多態位點處于中等或較低水平[36-37]。本研究中30對SRAP引物組合的PIC平均值為0.41，說明SRAP分子標記的引物組合可以很好地反映引物的區分能力，能有效準確度地揭示紅椿不同種源的遺傳多樣性。

針對含有大量次生代謝產物的母樹葉片，本研究采用了有效的處理方法，保證了DNA的提取質量；采用多種檢測手段進行SRAP分子標記體系優化，并獲得最優反應體系，彌補了單一優化選擇手段的不足，區別了各因素在體系中的影響作用。以上均為其他物種進行DNA提取及SRAP分子標記提供參考依據。

4 結論

本研究成功地獲得紅椿SRAP分子標記的最優體系，體系如下：25 μL體系中，模板DNA濃度為25 ng，引物濃度為0.3 μmol·L-1(正反引物濃度相同)、TaqDNA聚合酶為1 U、Mg2+濃度為 2.5 mmol·L-1及dNTP 濃度為0.3 mmol·L-1，2.5 μL 10×Buffer，重蒸水補齊體系。通過不同種源紅椿基因組DNA的重復驗證，同樣獲得了穩定清晰、多態性較強的擴增條帶，表明所確定的最優體系穩定可靠，適用性較強。利用最優體系進行紅椿SRAP分子標記的引物篩選，從1 505對引物組合中篩選出30對多態性高，重復性強的引物組合，用于紅椿后續遺傳多樣性研究中。

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(責任編輯：張 研)

ToonaciliataRoem.

LIPei1,QUEQing-min1,WANGFang1,LIJun-cheng1,ZHUQin2,LIAOBo-yong1,CHENXiao-yang1

(1.Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm, College of Forestry and Landscape Architecture,South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China; 2.Jiaying University, Meizhou 514015, Guangdong, China)

[Objective]To optimize the different components of sequence-related amplified polymorphism (SRAP)and to establish suitable SRAP-PCR system forToonaciliataRoem., and to select high-stability polymorphic band SRAP primer combinations. [Method]The experiment basis for genetic diversity ofT.ciliatewas established. Five factors each with eight concentration levels were screened to the suitable concentration range in the PCR reaction system using single factor experiment. After that, four levels were selected in each range of the five factors. The orthogonal experiment ofL16(45)was carried out for optimization. Combining with orthogonal design-direct analysis and SSR to optimize these factors and the optimized system was determined. [Result] The optimal SRAP-PCR system was established, containing 25 ng template DNA, 0.3 mmol·L-1each dNTP, 0.3 μmol·L-1each primer, 2.5 mmol·L-1each Mg2+and 1 UTaqDNA polymerase in a total volume of 25 μL. 30 primer combinations were selected from 1 505 s using the stability of the PCR system. [Conclusion]Through repeated validations using DNA of differentT.ciliataprovenances, the clear polymorphic bands were obtained. The result showed that the optimal SRAP-PCR system can be used for the follow-up experiments onT.ciliatagenetic diversity research in virtue of its stable, reliable, and good applicability.

ToonaciliataRoem.; SRAP-PCR; reaction system; optimization

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.002

2016-02-29

國家林業局林業公益性行業科研專項(201004020)。

李 培，博士，主要研究方向：林木遺傳育種。電話：15920837987。E-mail：lipei-meinv@163.com。地址:廣州市天河區五山路華南農業大學林學與風景園林學院614，郵編：510642。
* 通訊作者：陳曉陽，博士，教授。主要研究方向：林木遺傳育種。電話: 020-85280001。E-mail:zhbd0226@163.com 地址:廣州市天河區五山路華南農業大學林學與風景園林學院620，郵編：510642。

S817.46

A

1001-1498(2017)01-0010-08