白蠟及白蠟高級烷醇對人真皮乳頭細胞生長的影響

王占娣，馮 穎，李 嫻，丁偉峰，馬李一，陳曉鳴

(中國林業科學院資源昆蟲研究所，國家林業局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，云南 昆明 650224)

白蠟及白蠟高級烷醇對人真皮乳頭細胞生長的影響

王占娣，馮 穎，李 嫻，丁偉峰，馬李一，陳曉鳴*

(中國林業科學院資源昆蟲研究所，國家林業局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，云南 昆明 650224)

白蠟；白蠟高級烷醇；吐溫80；人真皮乳頭細胞

白蠟蟲(Ericeruspela(Chavannes))是一種重要的林業資源昆蟲，其主要寄主植物為白蠟樹(FraxinuschinensisRoxb.)和女貞(LigustrumlucidumAit.)。白蠟蟲雄性二齡幼蟲在寄主植物上分泌的次生代謝物質為白蠟。白蠟是我國的一種重要林副產品，采用氫化鋁鋰還原法或皂化法提煉后能夠得到高級烷醇[1-2]。高級烷醇能降低膽固醇，促進細胞成熟[3-4]；但是白蠟和高級烷醇均不溶于水，限制了人們對白蠟及高級烷醇的開發和利用。筆者通過研究發現：白蠟和白蠟高級烷醇能溶解到含有吐溫80的水溶液中，但吐溫80易誘導細胞的脫粒作用[5]。因此，用吐溫作為白蠟及高級烷醇的增溶劑進行生物活性篩選時需要考慮其對細胞的安全性。

人真皮乳頭細胞是毛囊生長調節的重要細胞，它存在于毛囊的基底部位，調控毛囊的生長、循環，指導毛基質細胞分化形成毛干，決定毛發的直徑[6]。因此，人真皮乳頭細胞成為體外篩選脫發藥物的首選細胞。考察藥物對細胞生長的影響通常采用的方法有MTT法和MTS 法，這2種方法均是采用比色法檢測細胞的生長，其原理是MTT和MTS試劑被活細胞內的脫氫酶產生的NADPH或NADH還原為有色的甲臜，而死細胞不能產生脫氫酶，因此，死細胞不能產生顏色。活細胞數量越多，產生的甲臜越多，培養基的顏色越深[7]，表明細胞增殖越旺盛。相對于MTT法，MTS法檢測時間短，安全性高，重復性好[8]。因此，本文采用MTS法研究不同用量的吐溫80對人真皮乳頭細胞生長的影響，并考察在吐溫80安全用量范圍內白蠟及白蠟高級烷醇在水中的增溶量對人真皮乳細胞的增殖作用，為白蠟及白蠟高級烷醇產品的開發和利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白蠟及白蠟高級醇由本課題組提供；人真皮乳頭細胞(批號2365)、真皮乳頭細胞生長培養基(批號184)、包被液(批號361)、消化液(批號322)購自美國Cell Applications。非那雄胺(M1122A)購自大連美侖生物科技有限公司。吐溫80(分析純)購自天津市風船化學試劑科技有限公司。DMSO(批號：302A0328)購自北京索萊寶科技有限公司。倒置顯微鏡，日本基恩士，型號VHX-1000。

1.2 細胞培養

人真皮乳頭細胞保存在液氮中，臨用前從液氮中取出，在37℃水浴中融化后，轉移到用包被液處理過的T-75培養瓶中，37℃，5%CO2培養箱內培養過夜，第2天更換完全培養基，繼續培養，待細胞融合度達到90%，用消化液消化，采用臺盼藍法測定細胞的活力，備用。

1.3 測試藥液的配置

1.3.1 吐溫80水溶液 將吐溫80配制成濃度為5%(w/v)的水溶液，用滅菌水稀釋成濃度250.00、125.00、62.50、31.25、15.60 μg·mL-1水溶液。

1.3.2 白蠟水溶液 將白蠟溶解到5%吐溫水溶液中，制備成濃度1.00 mg·mL-1的白蠟水溶液(制備方法已申請專利)，用滅菌水稀釋成濃度3.10、6.30、12.50、25.00、50.00 μg·mL-1的白蠟水溶液；

1.3.3 白蠟高級烷醇水溶液 將白蠟高級烷醇溶解到1%吐溫水溶液中，制備成濃度2.00 mg·mL-1的白蠟高級烷醇水溶液(制備方法已申請專利)，用滅菌水稀釋成濃度31.20、62.50、125.00、250.00、500.00 μg·mL-1的白蠟高級烷醇水溶液。

非那雄胺溶解到DMSO中配置成濃度0.74 μg·mL-1的溶液。

將上述溶液與培養基按1∶9混勻后，備用。

1.4 吐溫80、白蠟及白蠟高級烷醇液對人真皮乳頭細胞生長的影響

同時采用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。

1.5 統計分析

采用SAS9.1統計軟件中的ANOVA分析不同處理組細胞的增殖率和抑制率的平均值±SE，P<0.05表明有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同用量吐溫80對人真皮乳頭細胞生長的影響

不同字母表示不同處理組間差異顯著(P<0.05,下同),A:陰性對照;B:非那雄胺;C:處理藥劑中吐溫80濃度1.56 μg·mL-1; D: 處理藥劑中吐溫80濃度3.12 μg·mL-1;E:處理藥劑中吐80濃度6.25 μg·mL-1; F:處理藥劑中吐溫80濃度12.50 μg·mL-1; G:處理藥劑中吐溫80濃度25.00 μg·mL-1。Different lowercase were significantly different according to One-way analysis of variance(P<0.05,the same below).A: Negative control; B: Finasteride; C: Treatment agent including 1.56 μg·mL-1 tween80; D: Treatment agent including 3.12 μg·mL-1 tween80;E: Treatment agent including 6.25 μg·mL-1 tween80; F: Treatment agent including 12.5 μg·mL-1tween80;G: Treatment agent including 25.00 μg·mL-1 tween80.圖1 不同處理吐溫80對人真皮乳頭細胞增殖的影響Fig.1 The proliferation of human dermal papilla cells in difference tween80

2.2 白蠟對真皮乳頭細胞的增殖作用

A:陰性對照;B:非那雄胺;C:處理藥劑中吐溫80和白蠟的濃度分別為1.56、0.31 μg·mL-1;D:處理藥劑中吐溫80和白蠟的濃度分別為3.12、0.63 μg·mL-1;E:處理藥劑中吐溫80和白蠟的濃度分別為6.25、1.25 μg·mL-1;F:處理藥劑中吐溫80和白蠟的濃度分別為12.5、2.50 μg·mL-1;G:處理藥劑中吐溫80和白蠟的濃度分別為25.00、5.00 μg·mL-1.A: Negative control; B: Finastride; C: Treatment agent including 1.56 μg·mL-1 tween 80 and 0.31 μg·mL-1 white wax; D: Treatment agent including 3.12 μg·mL-1 tween80 and 0.63 μg·mL-1 white wax; E: Treatment agent including 6.25 μg·mL-1 tween80 and 1.25 μg·mL-1 white wax; F: Treatment agent including 12.5 μg·mL-1 tween80 and 2.50 μg·mL-1 white wax; G: Treatment agent including 25.00 μg·mL-1 tween80 and 5.00 μg·mL-1 white wax.圖2 白蠟對人真皮乳頭細胞的增殖作用Fig.2 The proliferation of human dermal papilla cells in difference white wax

2.3 白蠟高級烷醇對人真皮乳頭細胞的增殖作用

A:陰性對照; B:非那雄胺;C:處理藥劑中吐溫80和白蠟高級烷醇的濃度分別為1.56、3.12 μg·mL-1;D:處理藥劑中吐溫80和白蠟高級烷醇的濃度分別為3.12、6.25 μg·mL-1;E:處理藥劑中吐溫80和白蠟高級烷醇的濃度分別為6.25、12.5 μg·mL-1;F:處理藥劑中吐溫80和白蠟高級烷醇的濃度分別為12.50、25.00 μg·mL-1;G:處理藥劑中吐溫80和白蠟高級烷醇的濃度分別為25.00、50.00 μg·mL-1.A: Negative control; B: Finastride;C: treatment agent including 1.56 μg·mL-1 tween 80 and 3.12 μg·mL-1 white wax; D: treatment agent including 3.12 μg·mL-1 tween 80 and 6.25 μg·mL-1 white wax; E: treatment agent including 6.25 μg·mL-1 tween 80 and 12.5 μg·mL-1 white wax; F: treatment agent including 12.5 μg·mL-1 tween 80 and 25.00 μg·mL-1 white wax; G: treatment agent including 25.00 μg·mL-1 tween 80 and 50.00 μg·mL-1 white wax.圖3 白蠟高級烷醇對人真皮乳頭細胞的增殖作用Fig.3 The proliferation of human dermal papilla cells in difference policosanol of white wax

3 討論

4 結論

[1] 馬李一, 王有瓊, 張重權,等.蟲白蠟還原法制備高級烷醇混合物研究[J]. 林產化學與工業, 2009,29(5): 6-10.

[2] 馬李一, 王有瓊, 張重權,等.蟲白蠟制備高級烷醇工藝研究[J]. 食品工業科技, 2008,29(2): 179-181.

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[5] 張 嘉, 李 澎, 李貽奎, 等.吐溫80誘導RBL-2H3細胞脫顆粒作用研究[J]. 現代免疫學, 2009,29(3): 240-245.

[6] J. Lee, T. Tumbar. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling[J]. Seminars in cell & developmental biology, 2012, 23(8): 906-916.

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(責任編輯：張 玲)

Effect of White Wax and Policosanol from White Wax Tween Aqueous Solution on HFDPCS

WANGZhan-di,FENGYing,LIXian,DINGWei-feng,MALi-yi,CHENXiao-ming

(Research Institute of Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Key laboratory of Cultivating and Utilization of Resources Insects of State Forestry Administration, Kunming 650224, Yunnan, China)

[Objective]To investigate the cell proliferation effect of white wax and policosanol from white wax tween aqueous solution in human dermal papilla cells (HFDPCs). [Method]The cell seeding density was decided by Trypan blue test. Next day, change fresh medium which including treatment agent for HFDPCs. MTS assay was used to compare the proliferation effects of different concentrations of tween80, white wax and policosanol from white wax tween80 aqueous solutions on HFDPCs tween aqueous solutionafter 48 h.[Result]HFDPCs could grow wellwhenthe concentration of tween 80 was 1.56-6.25 μg·mL-1. In the concentration range, white wax (solubility in water was from 0.31-1.25 μg·mL-1) and policosanol from white wax (solubility in water was 3.125-12.5 μg·mL-1) tween aqueous solutions had the cell proliferation effect for HFDPCs. In which, the white wax aqueous solution including 6.25 μg·mL-1tween80 and 1.25 μg·mL-1white wax, and the policosanol aqueous solution which including 6.25 μg·mL-1tween80 and 12.5 μg·mL-1policosanol increased significantly the proliferation of HFDPCs comparing with finasteride.[Conclusion]The selected concentration of tween80 is below 6.25 μg·mL-1in HFDPCs culture when tween80 is used as a solubilizing agent. In the optimistic concentration range of tween80, the white wax and policosanol from white wax could increase the proliferation of HFDPCs remarkably.

white wax; policosanol from white wax; tween80; human dermal papilla cells

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.006

2016-09-19

國家公益性林業科研專項(201204602);國家863項目(2014AA021800)

王占娣(1981—)，女，河北任丘，在讀博士，主要從事資源昆蟲研究.E-mail: zhdwang@163.com.
* 通訊作者.

S899.1

A

1001-1498(2017)01-0041-05