10個南方皂莢群體遺傳多樣性的AFLP分析

李 偉，林富榮 ，鄭勇奇*，孫 圣

(1.中國林業科學研究院林業研究所，國家林業局林木培育重點實驗室，北京 100091;2.青島農業大學園林與林學院，山東 青島 266109)

10個南方皂莢群體遺傳多樣性的AFLP分析

李 偉1,2，林富榮1，鄭勇奇1*，孫 圣1

(1.中國林業科學研究院林業研究所，國家林業局林木培育重點實驗室，北京 100091;2.青島農業大學園林與林學院，山東 青島 266109)

[目的]研究南方皂莢的遺傳多樣性和遺傳結構現狀，為制定有效的保護策略和育種策略提供理論依據。[方法]采用擴增片段長度多態性技術對供試的215份皂莢的遺傳多樣性及遺傳距離進行分析。[結果]表明：檢測到1 782個位點，其中，有1 389個為多態性位點，多態位點百分率為77.94%；皂莢各群體Shannon’s信息指數平均為0.256；Nei’s多樣性指數平均為0.168，表明皂莢群體的遺傳多樣性偏低，皂莢群體間存在著一定的遺傳分化；根據遺傳距離UPGMA聚類分析，將10個群體劃分為4大類。由遺傳分化系數和分子方差分析結果發現，群體內的變異是皂莢遺傳變異的主體，74.79%的變異來自群體內。[結論]皂莢群體的遺傳多樣性與遺傳結構的形成不僅與其分布廣泛、種子特性及生活史有關，而且與人為的砍伐、引種、生境片段化等因素有重要關系。基于上述結果提出了皂莢的保護策略。

皂莢， AFLP標記，遺傳多樣性，遺傳結構

皂莢(Gleditsiasinensis)又名皂莢樹，為豆科皂莢屬植物，為我國重要的鄉土樹種，皂莢原產于我國長江流域，在我國大部分地區均有分布，多生于山坡林地、山谷及路旁。皂莢適應性強[1]、耐干旱，也具有很高的工業價值和藥用價值，是優良的中藥材[2]和工業原料[3]，可用作經濟林、用材林、防護林及園林綠化。盡管皂莢分布區域廣，但是近年來，由于人為的砍伐和自然環境的惡化，導致我國皂莢天然種群呈片段化分布，多數的群體以單株形式存在，皂莢野生種的數量逐漸減少，處于瀕危狀態，遺傳多樣性是物種的重要特征，也是研究物種多樣性的核心問題，它反映了物種對環境的適應能力。通過對物種遺傳多樣性的研究，對于揭示物種對環境演替的適應規律，對物種的保護和合理利用有著重要意義。擴增片段長度多態性AFLP分子標記具多態性豐富、可重復性強和穩定性高、標記覆蓋密度高、引物組合通用等優點，主要應用于品種鑒定[4]、遺傳多樣性評價[5]、分子標記連鎖圖譜構建[6]、數量性狀位點定位[7]以及親緣關系分析[8]。相比于測序技術，AFLP在分析精度上與測序方法存在明顯的差距，但是群體遺傳學研究通常需要通過多群體大樣本采樣分析，因此，基于成本、效率以及數據分析等因素的限制，測序技術在林木群體遺傳學研究領域的成功應用未見相關報道， AFLP技術在對于一些沒有參考基因組序列的植物，非常有用[9]，仍是進行植物遺傳多樣性研究的有力手段。

目前，國內外對皂莢開展了引種栽培[10]、抗逆性[1]、種實、刺特性與成分[2]等方面的研究，對皂莢的遺傳學研究主要集中在北方群體[14]，顧萬春等[11]對中國北方6個省市的皂莢進行了種源試驗，并構建了北方產區的核心種質；蘭彥平等[12]對北方自然分布區的皂莢表型多樣性進行了分析，研究發現，皂莢不同群體間絕大多數種子表型指標都存在極顯著差異；李偉等[13]對南方皂莢表型多樣性研究發現，皂莢果實、種子等性狀在群體間和群體內存在豐富的變異，群體內的變異是皂莢的主要變異來源。因此，為有效保護南方皂莢的遺傳資源，在6個省(市)采集10個皂莢天然群體，采用AFLP分子標記研究南方皂莢群體遺傳多樣性，揭示我國南方地區皂莢群體的遺傳多樣性和遺傳結構的現狀，為制定有效的保護策略和科學的育種策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

在勘查的基礎上，2011年11月采樣，選擇皂莢分布相對集中、具有代表性的10個群體，共計215個個體，具體地理位置詳見表1。株間距大于100 m，樣本采集盡量選擇生長正常，無病蟲害，在群體內選定的每個植株樹冠中部向南的位置采集嫩葉片，用硅膠干燥保存，帶回實驗室后保存在-80℃冰箱，備用。

表1 皂莢種群采集信息及樣本大小Table 1 Collecting data and samples size of G. sinensis

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 皂莢葉片DNA提取采用CTAB法，利用紫外分光光度計(NanoDrop8000, Thermo, American)檢測DNA質量以及濃度，DNA濃度稀釋到50 ng·μL-1，-20 ℃保存備用。

1.2.2 AFLP分析 AFLP實驗步驟參考黃平[14]的方法，僅對PCR反應體系和程序進行優化。接頭序列和預擴增引物序列由北京天根生物科技有限公司合成，選擇性擴增引物5’端添加Cy5熒光標記。

1.2.3 PCR產物檢測 PCR產物檢測參照黃平[14]的方法，原始數據分析使用系統自帶軟件。

1.2.4 數據處理 利用軟件NTSYS-pc2.1和Popgene3.2對皂莢群體進行遺傳多樣性和遺傳相似性分析，包括多態位點百分比(PPB)、Nei’s多樣性指數、Shannon’s信息指數I、遺傳距離(D)和遺傳一致度，對各群體進行UPGMA聚類分析和分子方差分析(AMOVA)。

2 結果與分析

2.1 AFLP擴增片段多態性

表2 AFLP引物組合多態性分析Table 2 AFLP primers and their amplification results

圖1 酶切電泳圖
Fig.1 The restriction patterns of G. sinensis

圖2 預擴增電泳圖
Fig.2 Preamplification electrophoretogram

2.2 遺傳多樣性分析

本研究表明：皂莢群體在種水平上的遺傳多樣性(Ht)為0.126，群體間的遺傳多樣性(Hs)占0.032，群體內的遺傳多樣性(Dst)為0.095，群體內的遺傳多樣性占74.79%，群體間的遺傳多樣性占25.21%，表明皂莢群體的遺傳多樣性主要存在于群體內部。

圖3 部分引物組合毛細管電泳圖Fig.3 Detection result of different premier capillary gel electrophoresis based on AFLP-marker

基因流(Nm)是表明基因在群體間的交換程度，根據公式Nm=0.5(1-Gst)/Gst得出皂莢群體種水平上的基因流為1.483，這說明皂莢群體的基因流處于中等偏下水平，群體間交流較少。

表3 皂莢種群遺傳多樣性指數Table 3 Genetic diversity of G. sinensis

2.3 群體變異的AMOVA分析

表4表明：皂莢不同群體的遺傳多樣性存在極顯著差異(P<0.01)，說明10個南方皂莢群體間均存在一定程度的遺傳分化。在總的遺傳變異中，73.13%的變異發生在群體內，只有26.87%發生在群體間，說明皂莢群體在群體內和群體間均存在遺傳變異，而群體內的變異是皂莢群體變異的主要來源(表4)，說明皂莢遺傳變異以群體內為主，AMOVA分析和遺傳多樣性指數分析結果相同。

2.4 皂莢群體關系與聚類分析

采用NTSYS-pc2.1軟件對皂莢群體進行UPGMA聚類分析(圖4)，10個群體的遺傳距離均大于0，這表明供試的10個群體間有相同的遺傳背景，但是各群體間又存在著一定差異，其中湖北恩施群體、湖北宜昌群體、湖北京山群體、重慶秀山群體這4個群體距離相近，群體間遺傳距離較小，可以聚為一類；四川成都群體、四川萬源群體、廣西桂林群體和湖南城步群體間遺傳距離較小，這4個群體聚為1類，以上2類基本與其地理分布格局相吻合，但貴州麻江群體和貴州興義群體的地理距離較近，但是并未優先聚在一起，各自聚為1類，這說明群體間的地理距離和群體間遺傳分化程度并沒有顯著的相關性。

表4 皂莢種群分子方差分析(AMOVA)Table 4 Molecular variance analysis (AMOVA) of G. sinensis

表5 皂莢群體間遺傳相似度和遺傳距離Table 5 Genetic similarity and genetic distance of G.sinensis populations

注：上三角為遺傳距離；下三角為遺傳一致度。

Note: Nei’s genetic identity(above diagonal)and genetic distance(below diagonal).

圖4 10個皂莢群體遺傳一致度UPGMA聚類圖Fig.4 UPGMA dendrogram of 10 G. sinensis populations using Nei’s biased genetic identity

3 討論

AFLP分子標記技術是對生物基因組進行分析的一種較為理想的方法，具有分析所需DNA量少、可重復性好、多態性強、分辨率高、樣品適用性廣等諸多特點，但是AFLP分析中也存在操作步驟繁瑣、銀染檢測靈敏度低、實驗效率低以及數據分析復雜的缺點。本研究通過加入熒光引物和毛細管電泳進行自動分析，使AFLP分子標記技術在遺傳多樣性的測定上更方便快捷，結果也更準確。皂莢是我國特有的鄉土樹種，在我國分布廣泛，但是由于人為破壞，我國皂莢呈片段化分布，多數的皂莢以單株形式存在，皂莢野生種的數量逐漸減少。到目前為止，有關皂莢遺傳資源評價工作并不多，對其遺傳背景也不清楚，這嚴重影響了皂莢遺傳資源的保護和利用。本研究從湖北、四川、重慶、湖南、廣西和貴州收集了10個群體，共計215份皂莢種質資源，對不同地區的皂莢遺傳資源進行遺傳多樣性評價。AFLP分析表明：所有14對熒光引物組合對215份樣品擴增出1 389條多態性條帶，多態性百分比達77.94%，平均每對引物的多態性條帶有99條。

群體的遺傳結構受到基因流、交配系統、突變和選擇等因素的影響。群體變異的分子方差分析(AMOVA)表明，10個南方皂莢群體間均存在著一定程度的遺傳分化，皂莢群體在群體內和群體間均存在遺傳變異，而群體內的變異(73.13%)是皂莢群體變異的主要來源。皂莢群體的遺傳分化系數(Gst)為25.21%，低于自交(0.65)和混合交配(0.40)系統植物，高于異交(0.27)系統植物，這與皂莢蟲媒異花授粉的特征不符，這可能是由于皂莢群體間的分布距離較遠，使得群體間呈現出一定的遺傳分化；此外，皂莢群體的遺傳分化系數高于栓皮櫟(QuercusvariabilisBl.) (4.55%)、銀葉樹(HeritieralittoralisDryand.) (23.94%)、秀雅杜鵑(RhododendronconcinnumHemsl.) (7.26%)，低于連香樹(cercidiphyllumJaponicumSieb.) (50.00%)、鵝掌楸(LiriodendronchinensisSargent.) (34.34%)，刺槐(RobiniapserdoacaciaLinn.) (42.03%)，觀光木(TsoongiodendronodorumSin.) (34.34%)、白花樹(StyraxtonkinensisCraib.) (34.04%)、珙桐(DavidiainvolucrateBaill.) (26%)、資源冷杉(AbiesziyuanensisL.K.Fu et S.L.Mo) (37.77%)，銀杉(CathayaargyrophyllaChun.) (26.00%)等樹種。物種的分布范圍會影響到群體間的分化，群體間如果由于生境破碎化等因素造成生殖隔離，則該群體間就會產生較大的遺傳差異[21]。目前，皂莢在我國分布呈散生的狀態，成片的天然林基本消失，人為的破壞嚴重，造成生境片段化以及交換種子花粉的幾率變小，從而導致皂莢群體的遺傳結構存在著一定的分化。

基因流影響著群體的遺傳結構，基因流的大小反映出群體遺傳結構的大小，通常來說，基因流越大，群體間的遺傳分化系數越小。基因流>1時說明該群體間存在著一定的基因流動[21]。本研究表明，皂莢群體的基因流(Nm=1.483)處于中等偏下水平，群體間的交流較少。本研究所用材料分布廣泛，其花粉和種子可以借助風力、昆蟲和鳥類進行遠距離傳播，因此，皂莢群體間有一定的基因交流；但是，由于皂莢散生分布的特點造成交換種子及花粉的幾率小，因此，群體間交流也相對較少。

大多數研究表明，遺傳關系和地理距離具有一定的相關性[22]，但也有研究表明，二者之間并不呈顯著的相關性[23]。根據Nei’s遺傳距離聚類分析可以看出，10個群體主要分為4大類，各類群體按地理空間分布聚在一起，但是也有例外，如湖南城步群體，這可能與湖南群體特定的分布范圍(多分布于村邊、路邊等人流量較大地區)和特定的環境條件(降雨量大)等有關，也可能是從四川等地引種等多因素造成的。

4 結論

本研究利用AFLP分子標記技術揭示了皂莢群體的遺傳多樣性，該結果比較全面的反映了我國南方皂莢群體的遺傳信息。(1)AFLP分析表明：所有14對熒光引物組合對215份樣品擴增出1 389條多態性條帶，多態性百分比達77.94%，平均每對引物的多態性條帶有99條。(2)皂莢群體在種水平上的遺傳多樣性為0.126，遺傳多樣性偏低；皂莢群體間均存在著一定程度的遺傳分化，皂莢群體在群體內和群體間均存在遺傳變異，而群體內的變異是皂莢群體變異的主要來源。(3)根據Nei’s遺傳距離聚類分析可以看出，10個群體主要分為4大類，各類群體主要按地理空間分布聚在一起。為更好的保護和利用皂莢遺傳資源需要廣泛的分析全國范圍內皂莢的遺傳多樣性，從皂莢生態效益、藥用價值和分子水平相結合來全面評價其遺傳多樣性。此外，對于保護皂莢遺傳資源來說，在開展原地保存和異地保存的同時建立種質資源收集圃進行保存。在進行皂莢的原地保存工作時，保護一個群體的完整性尤為重要；在對皂莢進行異地保存時，保存的個體盡量來自不同的居群，以保證基因流能在各居群間最廣泛的交流。

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(責任編輯：詹春梅)

Genetic Diversity of TenGleditsiasinensisPopulations from Southern China

LIWei1,LINFu-rong1,ZHENGYong-qi1,SUNSheng1

(1.Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration,Beijing 100091, China; 2.College of Landscape Architecture and Forestry, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong, China)

[Objective] To understand the genetic diversity ofGleditsiasinensis.[Method]215G.sinensissamples were analyzed using AFLP (amplified fragment length polymorphism) approach. [Result]The results showed that total of 1 782 loci ofG.sinensisgenome were examined for molecular variation in which 1 389 loci were polymorphism, accounting for 77.94%. The average Shannon’s andNei’sindex were 0.256 and 0.168, respectively. At the species level, the total genetic diversity (Ht) was 0.127, suggesting a lower genetic diversity inG.sinensispopulations. The gene flow and average genetic distance were 0.059 and 1.483, respectively. It is suggested that there were some genetic differentiations among the ten populations. The UPGMA cluster analysis showed that theG.sinensispopulations were divided four types. The variance within population was the main part of the genetic variation of the species according to the AMOVA andGstanalysis. [Conclusion]In combination with on-site investigation, it is conclude that the present status of genetic diversity and genetic structure ofG.sinensispopulations are strongly affected by wide distribution, fruit characteristics, chop, introduction and habitat fragmentation. Some suggestions on the gene conservation ofG.sinensisare proposed.

Gleditsiasinensis； AFLP marker； genetic diversity; genetic structure

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.007

2016-06-17

林業公益性行業科研專項(201504103)

李 偉(1981—)，男，山東濰坊人，博士，主要從事林木遺傳資源與改良方面研究.
* 通訊作者：鄭勇奇，男，研究員，主要從事林木遺傳資源方面研究.E-mail: zhengyq@caf.ac.cn.

S718

A

1001-1498(2017)01-0046-07