基于沙棘轉錄組序列開發EST-SSR分子標記

李珊珊，曾艷飛，何彩云，張建國,2*

(1.國家林業局林木培育重點實驗室，中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091；2.南京林業大學南方現代林業協調創新中心，江蘇 南京 210037)

基于沙棘轉錄組序列開發EST-SSR分子標記

李珊珊1，曾艷飛1，何彩云1，張建國1,2*

(1.國家林業局林木培育重點實驗室，中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091；2.南京林業大學南方現代林業協調創新中心，江蘇 南京 210037)

沙棘；轉錄組；EST-SSR；引物

沙棘屬(Hippophae)屬于胡頹子科(Elaeagnaceae)，是多年生落葉灌木、小喬木或喬木，風媒傳粉，雌雄異株，具有固氮作用，適應性極強，主要分布于中歐和中亞地區[7]。依據Sun等[7]和Bartish等[8]學者的系統分類，分為7個種和8個亞種。沙棘是集生態效益、經濟效益和社會效益為一體的多用途樹種，因其果實富含Vc和沙棘油，枝葉含高蛋白，根系有根瘤等特點備受矚目[9]。近些年，隨著DNA 分子標記技術的不斷發展與完善，針對沙棘遺傳多樣性、親緣關系和品種鑒定等的研究得到進展[10]，如利用RFLP、ITS、cpDNA等分子標記對沙棘進行了研究[7-8, 11]，但利用SSR分子標記對沙棘的研究較少, 同時目前開發可用的沙棘SSR引物較少，僅有孫燕琳等[12]利用葡萄SSR引物篩選適用于沙棘的SSR引物，Wang等[13]利用磁珠富集法開發的9對SSR引物和Jain等[14]利用EST開發的11對EST-SSR引物。為了豐富沙棘的SSR分子標記，本研究通過對向陽沙棘轉錄組序列進行分析，開發出大量EST-SSR標記，為沙棘親本分析、遺傳多樣性、遺傳育種等研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料及DNA提取

本研究中涉及轉錄組測序的沙棘品種“向陽”(H.rhamnoidessubsp. mongolica al Xiangyang)是俄羅斯專家通過天然蒙古沙棘選育所得。隨機選取采自新疆青河縣莫齊克村的天然種群蒙古沙棘中的16個個體，采用植物全基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物公司)從其葉片中提取總DNA，用于引物篩選和多樣性檢測。

1.2 EST序列來源、SSR檢測及SSR引物設計

1.2.1 EST序列來源 沙棘EST序列來源于本實驗室對“向陽”品種的轉錄組測序所得。收集向陽沙棘新鮮根、莖、葉提取RNA，構建cDNA文庫，再利用Illumina Hiseq2000測序平臺 (IlluminaInc)進行高通量測序，最后用 Trinity[15]軟件將測序序列拼接成無冗余的獨立基因集，即由EST序列組成的一個轉錄組。該實驗由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。所得轉錄組序列已提交到NCBI數據庫，序列號為SRP067785。

1.2.2 EST-SSR位點統計和引物設計 利用軟件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)檢測轉錄組序列中簡單重復序列，確定SSR位點。SSR的搜索標準為：單、二、三、四、五和六核苷酸的最少重復次數分別為10、6、5、5、5、5，同時搜索復合SSR。對不同SSR類型在轉錄組中的密度分布進行統計。

1.3 EST-SSR位點PCR擴增和篩選

1.4 沙棘EST-SSR多態性分析

從篩選出具有多態性(等位基因數≥2)的引物中，進一步篩選在蒙古沙棘個體中擴增成功率高、且上機檢測峰圖明晰的EST-SSR位點。利用GENALEX 6軟件計算每個位點在這16個沙棘個體中的等位基因數量、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(HE)。

2 結果與分析

2.1 沙棘ESR-SSR重復類型及頻率

對沙棘轉錄組中的EST序列去冗余后共收集17 383條具有SSR位點的序列，其中包括復合SSR類型序列828條，因其特殊性不計入SSR類型分析。在非復合的SSR類型中，單核苷酸重復類型數量最多，所占比例達到62.77%(10 392)；其次是二核苷酸和三核苷酸重復類型，所占比例分別為21.82%(3 613)和13.77%(2 279)。四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復類型較少，分別僅占1.45%(240)、0.09%(15)、0.10%(16)。

在所檢測到的3 613個二核苷酸重復EST-SSR中，AT和AG兩種類型的重復基元出現的次數較多，分別為1 814個(50.21%)和1 521(42.10%)(圖1a)。在檢測到的2 279個三核苷酸重復中，AAG為優勢類型，共783個(34.36%)，ATC和ATA兩種類型次之，分別為400個(17.55%)和395個(17.33%)(圖1b)。

圖1 沙棘ESR-SSR二核苷酸(a)和三核苷酸(b)重復基元類型及其數量Fig.1 Observed counts of identified microsatellite loci for different repeat sequence motifs of(a) di-nucleotide and (b) tri-nucleotide repeats from the transcriptome sequences of Hippophae

2.2 ESR-SSR的引物設計與篩選

利用Primer 3.0為9 291條EST序列設計了適宜的SSR擴增引物，剩余的8 092條序列沒能得到合適的引物。從設計的引物中隨機挑選179對二核苷酸、三核苷酸重復的EST-SSR引物進行PCR擴增檢測，發現142個位點能夠在預期片段大小的位置擴增出清晰的條帶，擴增效率為79.33%。

表1 沙棘17個多態EST-SSR位點的引物信息Table 1 Information of 17 Hippophae EST-SSR loci in transcriptome sequences and tested with 16 sample

3 討論

3.1 沙棘EST-SSR特性分析

本研究通過對具有SSR位點的17 383條EST序列的分析發現，在沙棘轉錄組序列中，單核苷酸重復類型的SSR最多，其次是二核苷酸重復類型和三核苷酸重復；四核苷酸，五核苷酸和六核苷酸重復類型的總和不到1.7%。由于單核苷酸的特殊性，大多數研究不將其作為SSR的研究對象[18]。因此，忽略單核苷酸重復不計，沙棘的EST-SSR位點以二核苷酸和三核苷酸重復類型為主，這與目前大多數植物的研究一致[19]。先前研究表明，二核苷酸重復在許多種的基因組中是常見類型，但是在編碼區出現的頻率低于非編碼區，編碼區常見的重復類型為三核苷酸。這可能是因為編碼區的序列為密碼子序列，隨著三核苷酸的增加或減少會改變閱讀框架[6]，但是不會引起移碼突變[20],而本研究中，二核苷酸重復類型所占比例高于三核苷酸重復類型，不同于胡楊EST-SSR的研究[20]。這可能是由于不同研究搜索SSR的標準(SSR重復類型、次數、長度等)不同造成的差異[19]。

在沙棘二核苷酸重復基元的EST-SSR位點中，AT 和AG是出現次數最多的兩種類型，分別占50.21%和42.10%；在三核苷酸重復基元中，AAG為優勢重復類型，占34.36%，ATC與ATA基元所占比例之和將近35%。沙棘的重復基元的主要類型與白樺、銀杏、楊樹、北美鵝掌楸、火炬樹、蒙古櫟等木本植物基本相同[2]，與水稻、高粱、玉米等作物存在差異，不同物種之間重復基元存在的差異可能與各研究所用EST來源及數目不同，也可能與物種轉錄組的特異性等有關[21]。

3.2 沙棘EST-SSR引物擴增效果及多態性

本研究設計的EST-SSR引物在天然蒙古沙棘種群中擴增效率較高，達到79.33%。剩余引物無法擴增的原因可能是：基因組DNA存在許多內含子片段，SSR位點所設計的一端或兩端引物的位置剛好位于內含子或者外顯子剪切點，致使引物在基因組中找不到結合位點[19]。另外，在引物的初篩過程中統一采用55 ℃退火進行PCR，這也可能造成最適退火溫度低的引物無法成功擴增。

判斷SSR分子標記可用性的主要依據是其多態性，本研究通過對天然蒙古沙棘種群的16個個體分析，發現40對具有多態性的引物，多態比率為43.48%，低于胡楊(P.euphraticaOliv.，52.5%)[20]和中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.，81.25%)[22]，高于銀杏(GinkgobilobaLinn.，31.9%)[23]。對17個擴增穩定且上機峰圖明細的位點進一步分析，得到來自新疆的天然蒙古沙棘種群遺傳多樣性處于中等水平(HO=0.488，HE=0.514)。由于沙棘為雌雄異株，所以沙棘種群的遺傳多樣性相對較高，不同位點多樣性水平差別較大,但是這些位點的平均多樣性水平仍高于Wang等[13]利用磁珠法開發的基因組SSR所估算的中國沙棘亞種的多樣性。這說明利用編碼區的SSR位點估計的遺傳多樣性水平不一定低于基因組SSR位點。

4 結論

本研究利用EST序列成功開發了40對具有多態性的沙棘引物。利用蒙古沙棘的16個樣品對2種開發的引物進行多態性水平的檢驗和多態性相關分析，發現利用序列數據開發的引物多樣性高且多態性信息含量相對比較豐富，可為沙棘屬植物進行遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建系統發育分析和分子育種等多個方面的研究提供有力的支持

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(責任編輯：詹春梅)

Development of EST-SSR Markers Based on Seabuckthorn Transcriptomic Sequences

LIShan-shan1,ZENGYan-fei1,HECai-yun1,ZHANGJian-guo1,2

(1.Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry,Beijing 100091, China; 2.Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University,Nanjing 210037, Jiangsu, China)

[Objective]The transcriptomes ofHippophaerhamnoidessubsp.mongolicacv‘Xiangyang’ were analyzed to design primers and develop EST-SSR (Expressed Sequence Tags-Simple Sequence Repeat) markers.[Method]The primers were designedand the SSR was developed based on the Expressed Sequence. 179 pairs of primers were validated randomly. [Result]17 383 SSR-ESTs (SSR-containing EST) were identified. Of the total EST-SSRs, the mononucleotiderepeat was the most dominant type, accounting for 62.77%, followed by dinucleotiderepeats and trinucleotiderepeats, accounting for 21.82% and 13.77%, respectively. AT and AG were the most abundant dinucleotide motifs; AAG, ATC and ATA were repeated dominant motifs in trinucleotide. Based on these SSR-ESTs, 9 291 pairs of EST-SSR primers were designed; 179 pairs of primers were randomly selected and compounded for PCR amplification, among which 142 loci were amplified successfully. Amplificationproductions of 92 loci were genotyped using the DNA analyzer, of which 40 loci (43.48%) were identified as polymorphism. At last, 17 loci that amplified highly successfully and genotyped easily were recommend and analyzed for naturalH.rhamnoidessubsp.mongolicaindividuals, with observedheterozygosity (HO) ranged from 0.083 to 0.875 and expected heterozygosity (HE) ranged from 0.180 to 0.750. [Conclusion]These EST-SSR markers would be valuable for further research on genetic diversity analysis, linkage mapping construction and molecular breeding of the genusHippophae.

Hippophaerhamnoides; transcriptome; EST-SSR; primer

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.0010

2016-01-04

林業公益性行業科研專項(201504103)

李珊珊(1989—)，女，河北邢臺人，碩士，主要從事分子生態學研究.
* 通訊作者.E-mail: zhangjg@caf.ac.cn

S718.46

A

1001-1498(2017)01-0069-06