去泛素化酶Rpn11在套細胞淋巴瘤中的表達及其臨床病理意義

雷堅　劉小柳　張蕓　曾亮　劉志紅

摘要：目的：探討去泛素化酶Rpn11蛋白在套細胞淋巴瘤（MCL）中的表達及其臨床病理意義。方法：收集20例初治MCL的標本及資料，以10例反應性增生淋巴組織標本為對照，免疫組化檢測組織中Rpn11蛋白的定位及表達，分析Rpn11表達與患者的臨床病理指標的關系。結果：Rpn11蛋白定位于細胞核和細胞漿。MCL病理組織中Rpn11蛋白表達陽性率85%，高于對照組織40%（P=0.03）。套細胞淋巴瘤組織中Rpn11蛋白表達的陽性率與患者的Ann Arbor分期、血清白蛋白水平、Ki-67指數均相關（P<0.05），與呈陰性表達的MCL比較，Rpn11陽性者分期更晚、白蛋白水平更低、Ki-67指數更高。而Rpn11表達與患者的MIPI分組、B癥狀、骨髓浸潤、pz一微球蛋白無關（P>0.05）。結論：Rpn11蛋白在MCL病理組織中的表達較對照組織為高，Rpn11可能是MCL預后較差的指標。

關鍵詞：套細胞淋巴瘤；Rpn11；去泛素化；免疫組化

中圖分類號：R733.4 文獻標志碼：A 文章編號：1008-2409（2016）05-0001-05

套細胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma，MCL）屬于非霍奇金淋巴瘤中成熟B細胞腫瘤的一種，以t（11；14）（q13；q32）和Cyclin D1過度表達為其分子遺傳學特征，2008年WHO將MCL定為“高度侵襲性”，80%～90%患者確診時為Ann ArborⅢ、Ⅳ期，中位生存時間3～5年。作為一種侵襲性高、早期發現困難的淋巴瘤，MCL發生的病理機制及疾病進展的分子基礎仍不明確。泛素-蛋白酶體途徑是真核生物細胞內蛋白選擇性降解的重要途徑。泛素-蛋白酶體系通過參與癌性轉化、腫瘤進展、免疫逃逸及腫瘤耐藥等諸多代謝過程，影響腫瘤的發生發展。臨床研究表明MCL是所有非霍奇金淋巴瘤中對蛋白酶體抑制劑最敏感的-類淋巴瘤，提示泛素-蛋白酶體系統在套細胞淋巴瘤的發生發展中存在功能紊亂。泛素-蛋白酶體系統中去泛素化酶可以避免錯誤修飾的蛋白進入泛素化降解途徑。去泛素化酶Rpn11（Regulatory particle non-ATPase 11）是蛋白酶體19s調節亞基蓋子的組成部分，Rpn11亞基作為蛋白酶體中最保守的非ATP酶，其在蛋白酶體去泛素化過程中發揮多效性作用，但目前國內外尚未見關于Rpn11在MCL中作用的研究報道。本研究采用免疫組化方法檢測Rpn11在MCL組織中的表達情況，探討其與MCL臨床預后指標的關系，為MCL的臨床治療及預后評估提供相關依據。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究收集2013年1月至2015年12月經中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院病理科確診的初治MCL標本共20例作為研究對象。所有病例均經組織病理學及免疫組織化學、骨髓或外周血免疫表型確診，分期依據Ann Arbor標準，危險度分層按照套細胞淋巴瘤國際預后指數（MIPI）標準進行。收集患者臨床資料，包括性別、年齡、MIP1分組、Ann Arbor分期、是否骨髓浸潤、B癥狀、β₂-微球蛋白、血清白蛋白、Ki-67指數。另選10例反應性增生的淋巴結組織標本作為對照。

1.2方法

1.2.1詘劑 Rpn11〔Anti-PSMD14 antibody（EPR4257）abl09123〕兔單克隆抗體購自abcam公司。DAB染色液試劑盒購自福州邁新生物技術公司。

1.2.2免疫組化 所有標本均經10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，2.5μm厚度連續切片。4μm厚的連續切片用于免疫組化檢測，切片經過烤片，二甲苯脫蠟，經檸檬酸抗原修復液進行微波修復20 min，3%H₂O₂孵育10 min，非免疫血清孵育10 min，滴加Rpn11兔單克隆抗體（1：500稀釋），4℃冰箱孵育過夜。然后按照福州邁新生物技術公司DAB染色液試劑盒操作說明書染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。

1.2.3結果判定 免疫組化結果參考Friedrichs標準進行評分：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；著色細胞占計數細胞百分率≤5%為0分，6%～20%為1分，21%～50%為2分，≥51%為3分；染色程度與染色細胞百分率得分乘積為最后得分，>1分判為陽性表達；≤1分判為陰性表達。

1.3統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件對資料進行統計分析，率的比較采用Fisher確切概率法。選擇雙向檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 MCL臨床病理資料分析

MCL患者20例，男16例，女4例；中位年齡59.5（44～77）歲；Ann Arbor分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期4例，Ⅲ期9例，Ⅳ期6例。MIPI危險度分組：低危10例（50%），中危7例（35%），高危3例（15%）。骨髓侵犯6例，脾臟受累2例，腸道受累5例。其中9例患者存在B癥狀。免疫表型顯示：MCL細胞均表達CD20和CD5，T細胞抗原CD3陰性，均表達bcl-2與Cvclin D1，CD10、bcl-6陰性或弱陽性。

2.2 Rpn11蛋白在MCL及反應性增生淋巴結中的表達

HE染色可見腫瘤細胞呈小到中等體積的淋巴樣細胞，胞核不規則，變異性染色質密集，核仁不明顯。Rpn11定位于細胞核和細胞漿，呈棕黃色。實驗結果顯示MCL組織中Rpn11陽性表達率為85%（17/20），反應性增生的淋巴結組織中陽性表達率為40%（4/10），兩者相比差異有統計學意義（P=0.03）。詳見圖1。

2.3 MCL患者Rpn11蛋白表達水平與臨床病理特征的相關性分析

套細胞淋巴瘤組織中Rpn11蛋白表達的陽性率與患者的Ann Arbor分期、血清白蛋白水平、Ki-67指數均相關（P<0.05）；與呈陰性表達的MCL患者比較，Rpn11陽性患者的分期更晚、白蛋白水平更低、Ki-67指數更高。而Rpn11表達與患者的MIPl分組、B癥狀、骨髓浸潤、β₂-微球蛋白水平無關（P>0.05）。詳見表1。

3討論

近年來，隨著淋巴瘤分子標志物研究的深入，如Ki-67、TP53、SOX11、IGHV等許多與MCL預后密切相關的分子標志物被發現，另外，一些有關信號通路、表觀遺傳學等的分子標記物正在研究中。本研究通過免疫組化技術，發現去泛素酶Rpn11在套細胞淋巴瘤組織中表達增強，提示泛素一蛋白酶體系統異常參與套細胞淋巴瘤的發生發展。分析Rpn11表達與MCL臨床相關指標的關系發現，Rpn11陽性患者的分期更晚、白蛋白水平更低、Ki-67更高，提示Rpn11可能是MCL的一項預后差的指標。

泛素-蛋白酶體系統存在于所有真生物的細胞內，通過蛋白酶體降解泛素標記的蛋白，是蛋白質選擇性降解的主要方式。去泛素化通過影響細胞周期、調節細胞增殖及分化、調節細胞凋亡等參與腫瘤的發生和進展。哺乳動物細胞中，3種去泛素化酶與26 s蛋白酶體相關：USP14、UCHL5和Rpn11。研究發現，USP14和UCHL5的小分子靶向抑制物b-AP15可以誘導骨髓瘤細胞凋亡，并且可以逆轉硼替佐米的耐藥，此外，b-AP15抗MM骨髓瘤活性還與下調Cyclin B1、導致腫瘤細胞周期停滯相關。最近研究發現，b-AP15可以誘導華氏巨球蛋白血癥（B細胞非霍奇金淋巴瘤中的一種）腫瘤細胞的凋亡。另有研究發現Rpn13在骨髓瘤細胞中高表達，并且臨床前數據證實靶向Rpn13抑制劑可以逆轉蛋白酶體抑制劑bortezomib耐藥、改善骨髓瘤患者預后。以上研究結果提示，作為以Cyclin D1過表達為特征的小B細胞非霍奇金淋巴瘤，套細胞淋巴瘤的發生可能與去泛素化酶功能失常相關。筆者研究發現Rpn11在MCL組織中陽性率較反應性增生淋巴結組織高，提示除了蛋白酶體抑制劑，去泛素化酶也有可能成為MCL治療的潛在靶點，這為去泛素化酶抑制劑用于治療MCL提供了理論上的可行性。