胚胎干細胞/誘導多能干細胞向間充質干細胞轉化的研究進展

孫養鵬 張志光

（中山大學光華口腔醫學院·附屬口腔醫院·口腔醫學研究所，廣東廣州510055）

·綜述·

胚胎干細胞/誘導多能干細胞向間充質干細胞轉化的研究進展

孫養鵬 張志光

（中山大學光華口腔醫學院·附屬口腔醫院·口腔醫學研究所，廣東廣州510055）

胚胎干細胞（ESCs）/誘導多能干細胞（iPSCs）因其有潛在成瘤性，制約了它的臨床應用。間充質干細胞（MSCs）具有多向分化能力、免疫調節功能以及低免疫原性，且仍未發現它有成瘤性，因而成為干細胞治療頗具臨床應用價值的種子細胞。近年來研究發現應用合適的誘導方案可以從ESCs/iPSCs獲取MSCs，結合ESCs/iPSCs的無限自我更新能力，ESCs/iPSCs向MSCs轉化將可能是獲取MSCs的一種數量充足且穩定的新來源。本文將對目前ESCs/iPSCs向MSCs轉化的方法、機制以及新衍生的MSCs的免疫調節功能、干性特征做一綜述。

胚胎干細胞；誘導多能干細胞；間充質干細胞

胚胎干細胞（ESCs）和誘導多能干細胞（iPSCs）擁有無限的自我更新能力以及多胚層分化能力，可以在體外維持足量的細胞儲備。由于ESCs存在倫理爭論、免疫抑制以及潛在的成瘤性，限制了它在臨床上的應用。近年來，來源于成體細胞的iPSCs擺脫了ESCs的倫理困境。同時，它擁有與ESCs相似的胚胎干細胞特性，使得其較ESCs具有更為優越的臨床應用前景。然而，其潛在的成瘤風險仍是制約其臨床應用的關鍵。研究表明，MSCs在移植的過程中具有多向分化能力、免疫調節功能以及免疫耐受性[1]。MSCs能夠遷移到受損組織處，通過分泌細胞因子、化學因子以及分泌細胞外基質蛋白促進組織損傷修復。且目前仍未有研究發現MSCs具有成瘤性。因此，MSCs是干細胞治療頗具臨床應用價值的種子細胞。MSCs存在于骨髓、脂肪組織、牙髓、滑膜、滑液以及肌肉等身體多處組織器官里。MSCs的獲取需選擇合適的供體，同時多數操作過程有創，且質和量差異較大。因此，建立一種穩定地、數量充足的MSCs獲取來源對于臨床應用是必不可少的。

研究報道應用合適的誘導方案可以從ESCs/ iPSCs獲取MSCs，ESCs/iPSCs的無限自我更新能力，ESCs/iPSCs向MSCs轉化策略將可能是獲取臨床應用級別MSCs的一種數量充足且穩定的來源。目前，ESCs/iPSCs向MSCs轉化的分子機制不明，而且轉化方法較多，且轉化效率參差不齊，不同方法轉化而來的MSCs干細胞特征異質性大。本文將對目前人ESCs/iPSCs向MSCs轉化的方法、分子機制以及新衍生的MSCs（ESCs/iPSCs-MSCs）的免疫功能特征，表型、分化潛能等干性特征做一綜述。

1 ESCs/iPSCs向MSCs轉化的方法

1.1 通過與飼養層細胞共培養的方式實現轉化：Trivedi等[2]將ESCs接種于鼠細胞OP9飼養層中共培養8天分離出了MSCs，同時在2周時利用CD34分選可獲得造血干細胞。

1.2 通過形成擬胚體再用低密度體外擴增或者分選技術從擬胚體中分離出MSCs：Barbet等[3]先通過36天懸浮培養形成擬胚體，將擬胚體在纖原蛋白元包被板上貼壁培養4周，胰酶消化后，MSCs培養基傳代培養于明膠包被板上，從而獲得MSCs。Villa-Diaz等[4]將ESCs懸浮培養7天，形成的擬胚體接種于明膠包被板，將貼壁細胞多次傳代培養后形成MSCs。Hong等[5]先將ESCs懸浮培養2天形成擬胚體，接種于多孔膜transwell上室，多孔膜允許帶有EMT標志和MSCs標志的細胞通過，從而獲得均一的MSCs。

1.3 引導ESCs/iPSCs克隆團出現二維自然分化：通過低密度體外擴增或者分選技術從分化細胞中分離出MSCs。Olivier等[6]通過機械分離胚胎干細胞克隆周圍分化細胞后，體外傳代培養，形成表皮樣細胞后，約50～180天再次進行體外傳代培養可獲得MSCs。Boyd等[7]應用內皮細胞培養基EGM2-MV誘導ESCs分化，20～30天后將形成內皮細胞后體外傳代2～3次可獲得MSCs。Gruenloh等[8]通過延長ESCs培養基的更換時間誘導ESCs克隆分化，手動挑去可見克隆團，擴增培養分化細胞，多次傳代培養后可獲得MSCs。Yen等[9]用MSCs培養基誘導ESCs分化增殖，應用胰酶消化傳代，可獲得MSCs。Wang等[10]先將ESCs定向誘導成為滋養層細胞后，用重組酶TrypLE消化后傳代于明膠包被板，可形成MSCs。

1.4 聯合細胞外基質和細胞因子誘導單細胞狀ESCs/iPSCs發生轉化：Lai等[11]用胰酶將ESCs消化成單細胞后，接種于明膠包被板，在MSCs培養基中添加FGF2和PDGF AB或者添加FGF2和EGF，經低密度傳代后可獲取均一的MSCs。Liu等[12]將ESCs和iPSCs用胰酶打散成單細胞后，接種于I型膠原包被板，用MSCs培養基添加維生素C、地塞米松和ROCK抑制劑Y-27632培養，細胞貼壁后，胰酶消化傳代于標準培養板，從而獲得MSCs。課題組[13]應用胰酶將ESCs消化成單細胞后，接種于Matrigel包被板，MSCs培養基添加ROCK抑制劑Y-27632培養，胰酶多次消化傳代于標準培養板，從而獲得MSCs。

1.5 單純細胞外基質誘導克隆團塊狀ESCs/iPSCs發生轉化：Hynes等[14]先將iPSCs消化機械分離后，接種于明膠包被板，間充質干細胞培養2周，重組酶TrypLE消化，按1：3傳代，第2代后，不用明膠包被板，傳至5～10代可形成均一MSCs。

1.6 單純添加細胞因子誘導單細胞狀ESCs/iPSCs發生轉化：Chen等[15]用擬胚體培養基添加TGF-β抑制劑SB431542誘導ESCs克隆分化，重組酶TrypleSelect消化成單細胞懸液，MSCs培養基傳代培養，可獲得MSCs。 1.7通過在ESCs/iPSCs中過表達基因實現轉化：Liu[16]等發現在ESCs過表達HOXB4，2周后可獲得36%CD73+MSCs，經體外傳代3次后，可獲得均一的MSCs。

2 ESCs/iPSCs向MSCs轉化的機制研究

目前，ESCs/iPSCs向MSCs轉化的分子調控機制研究十有分有限。近期研究發現通過抑制IκB激酶（IKK）/NF-κB信號通號能抑制ESCs表達胚胎干細胞標志，促進其表達間充質干細胞標志，從而有效地促進人ESCs向MSCs轉化。Chen等[15]報道抑制TGFβ/activin/nodal信號通路能促使ESCs向MSCs轉化。

3 ESCs/iPSCs-MSCs的免疫調節功能

Wang等[10]研究中ESCs-MSCs能有效抑制T、B淋巴細胞增殖，與骨髓MSCs不同，IFNγ刺激不會上調其表達炎性介質。同時，它還高表達免疫抑制配體PD-L1。研究發現iPSCs-MSCs通過旁分泌遷移抑制因子和生長分化因子-15在蒽環霉素誘導的心肌病中起保護心肌作用。有報道iPSCs-MSCs能維持CD34+造血干細胞的自我更新和增殖能力，同時它能抑制CD4+細胞增殖，在混合淋巴細胞反應中減少促炎因子的分泌，同時增加調節T淋巴細胞的數量。研究發現ESCs-MSCs與BMMSCs相似，能抑制CD4+或者CD8+淋巴細胞增殖，但ESCs-MSCs抑制NK細胞介導的細胞溶解比BMMSCs強；同時它還能抑制NK細胞的毒性效應，下調NK細胞激活受體NKp30和NKp46。

4 小結和展望

ESCs/iPSCs向MSCs轉化為臨床干細胞治療提供新的細胞來源。ESCs/iPSCs-MSCs細胞擁有與BMMSCs類似的免疫調節功能以及多向分化能力，同時無成瘤性，使得其在再生醫學中十分有前景。由于ESCs/iPSCs向MSCs的分子機制認識十分有限，目前ESCs/iPSCs向MSCs的方法呈多樣化且效率差參不齊，ESCs/iPSCs向MSCs的分子機制研究將是未來研究的熱點。

［1］Nauta J，Fibbe WE.Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells［J］.Blood，2007，110（10）：3499-3506.

［2］Trivedi P，Hematti P.Simultaneous generation of CD34+ primitive hematopoietic cells and CD73+mesenchymal stem cells from human embryonic stem cells cocultured with murine OP9 stromal cells［J］.Experimental hematology，2007，35（1）：146-154.

［3］Barbet R，Peiffer I，Hatzfeld A，et al.Comparison of gene expression in human embryonic stem cells，hESC drivedmesenchymal stem cells and human mesenchymal stem cells[J].Stem Cells Int，2011，2011：368192.

［4］Villa-diaz LG，Brown SE，Liu Y，et al.Derivation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells cultured on synthetic substrates［J］.Stem cells，2012，30（6）：1174-1181.

［5］Hong KS，Bae D，Choi Y，et al.A porous membrane mediated isolation of mesenchymal stem cells from human embryonic stem cells［J］.Tissue Eng Part C Methods，2015，21（3）：322-329.

［6］Olivier EN，Rybicki AC，Bouhassira EE.Differentiation of human embryonic stem cells into bipotent mesenchymal stem cells［J］.Stem cells，2006，24（8）：1914-122.

［7］Boyd NL，Robbins KR，Dhara SK，et al.Human embryonic stem cell-derived mesoderm-like epithelium transitions tomesenchymalprogenitorcells［J］.TissueEngineeringPart A，2009，15（8）：18971-907.

［8］Gruenloh W，Kambal A，Sondergaar D，et al.Characterization and in vivo testing of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells［J］.Tissue Engineering Part A，2011，17（11-12）：1517-1525.

［9］Yen ML，Hou CH，Peng KY，et al.Efficient derivation and concise gene expression profiling of human embryonic stem cell-derived mesenchymal progenitors（EMPs）［J］.Cell transplantation，2011，20（10）：1529-1545.

［10］Wang X，Lazorchak AS，Song L，et al.Immune modulatory mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells through a trophoblast-like stage［J］.Stem Cells，2016，34（2）：380-391.

［11］Lai RC，Choo A，Lim SK.Derivation and characterization of human ESC-derived mesenchymal stem cells［J］. Methods in Molecular Biology，2011，698（3）：141-150.

［12］Liu Y，Goldberg AJ，Dennis JE，et al.One-step derivation of mesenchymal stem cell（MSC）-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating［J］. PLoS One，2012，7（3）：e33225.

［13］Zheng YL，Sun YP，Zhang H，et al.Mesenchymal stem cells obtained from synovial fluid mesenchymal stem cell-derived induced pluripotent stem cells on a matrigel coating exhibited enhanced proliferation and differentiation potential［J］.PLoS One，2015，10（12）：e0144226.

Researching Advances in Embryonic Stem Cell/induced Pluripotent Stem Cell Transforming into Mesenchymal Stem Cells

Sun YangpengZhang Zhiguang
（Guanghua School of Stomatology，Hospital of Stomatology，Sun Yat-sen University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology，Guangzhou 510055，China）

The application of embryonic stem cells（ESCs）/induced pluripotent stem cells（iPSCs）in clinical is limited because of its potential tumorigenicity.Mesenchymal stem cells（MSCs）possess multipotent differentiation capacity，immunoregulatory function and low immunogenicity.Furthermore，no tumorigenicity was observed so far.All the this make MSCs a promising cell source for cell based threapy in clinical application.Recent studies have found that MSCs could be obtained from ESCs/iPSCs through a suitable induction program.In addition，ESCs/iPSCs possess unlimited self-renewal capacity.Therefore，ESCs/iPSCs transforming to MSCs will likely be a promising，stable new cell source for obtaining sufficient MSCs.In This paper，we will present the programs about ESCs/iPSCs transforming to MSCs and the underlying mechanisms that were reported so far，meanwhile，the stemness characteristics and immunoregulatory function of these new MSCs were also reviewed.

Embryonic stem cells；Induced stem cells；Mesenchymal stem cells

R392

A學科分類代碼：32011

1001-8131（2017）03-0282-03

2016-10-08