spo0A基因在艱難梭菌生長及芽孢形成中的作用

宋曉蕾， 周芬芬， 吳 湜， 高 瓊， 黃海輝， 陳軼堅

·論著·

spo0A基因在艱難梭菌生長及芽孢形成中的作用

宋曉蕾， 周芬芬， 吳 湜， 高 瓊， 黃海輝， 陳軼堅

目的 了解spo0A基因對艱難梭菌臨床分離株生長和芽孢產生的影響。方法 采用ClosTron敲除技術構建艱難梭菌臨床分離株C25的spo0A基因突變株，分光光度計檢測菌液濃度并繪制生長曲線，孔雀綠染色法計數芽孢和營養細胞。結果 艱難梭菌臨床分離株C25的spo0A基因敲除突變株和敲除前親代株的48 h生長曲線無明顯差異，但突變株不再產生芽孢。結論 spo0A基因是艱難梭菌芽孢形成過程中的關鍵基因，但并非其生長過程中的主要基因。

艱難梭菌； 芽孢； spo0A基因； 生長曲線

艱難梭菌（Clostridium diff cile）為革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，是醫院獲得性腹瀉最主要的病原菌，約25 %～33 %抗生素相關性腹瀉以及90 %假膜性腸炎由艱難梭菌所致，統稱為艱難梭菌感染（Clostridium diff cile infection， CDI）[1]。大多數的CDI發生在住院患者中，但近10年社區獲得CDI急劇上升，約占新發感染的1/3[2]。

芽孢是艱難梭菌在外界環境中的主要存在形式，也是艱難梭菌感染廣泛傳播的原因之一。DNA結合蛋白Spo0A是細胞從營養生長期進入芽孢形成時期的關鍵應答調節蛋白。對模式微生物枯草芽孢桿菌的研究表明，當Spo0A的含量和磷酸化水平達到一定閾值后，芽孢形成才開始啟動[3-4]。有報道Spo0A在艱難梭菌持續感染和傳播中起重要作用[5-6]。本研究采用ClosTron技術構建艱難梭菌spo0A基因突變株，對Spo0A在艱難梭菌臨床分離株生長和芽孢形成中的作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 艱難梭菌臨床株C25分離自我院腹瀉患者糞便。經鑒定該菌株為核糖體014型，產A毒素和B毒素。VPI10463為實驗室標準菌株，產A毒素和B毒素。大腸埃希菌感受態細胞HB101購自日本TaKaRa公司。pMTL007-E2質粒為英國諾丁漢大學Nigel Minton惠贈。

1.1.2 主要試劑 Brucella瓊脂為美國BBL Microbiology system產品，蛋白胨-酵母基礎肉湯（TY肉湯）和SAB肉湯為英國OXOID公司產品。環絲氨酸、頭孢西丁等藥物購自大連美侖生物技術有限公司。引物由DNA 2.0公司（美國）或上海生物工程技術服務有限公司合成。TargeTron gene knockout system kit為美國Sigma-Aldrich公司產品。孔雀綠為中國國藥集團化學試劑有限公司產品。番紅染液為上海科瑪嘉微生物技術有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 構建艱難梭菌spo0A基因突變株 在http：//www.clostron.com中選取合適的目的基因突變位點，生成IBS、EBS2、EBS1d、EBS Universal引物序列，由DNA2.0 公司合成上述引物序列并進行PCR，純化突變所需內含子片段，按TargeTron gene knockout system kit說明書操作完成該內含子片段與pMTL007-E2質粒的重組。將重組質粒導入E. coli HB101感受態細胞，氯霉素平皿篩選。將篩選后含有重組質粒的大腸埃希菌與親代菌株混合培養進行接合實驗。用甲砜霉素-頭孢西丁-環絲氨酸平皿與紅霉素平皿篩選艱難梭菌接合子[5,7]。在含紅霉素的篩選平皿上隨機挑取6個接合子菌落，采用3對驗證引物進行PCR并測序。引物序列見表1。

表1 引物及序列Table 1 Primers and the corresponding oligonucleotide sequences in this study

1.2.2 繪制細菌生長曲線 純分后的艱難梭菌菌株在厭氧工作站中（Ruskinn，英國）37 ℃培養16 h后取1 mL菌液加入到150 mL預還原TY肉湯中，置于搖床上厭氧培養，記為0 h。前18 h中每隔3 h從厭氧培養TY肉湯中取樣3 mL，于紫外可見光分光光度計上測量D600值，之后于24 h、48 h取樣測量D600值，繪制生長曲線。

1.2.3 計算產芽孢率 分別于第12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h取上述菌液1 mL，離心3 000×g，10 min，留取沉淀，加入適量PBS和5 %孔雀綠水溶液等量混合，100℃加熱25 min，涂片，干燥，加熱固定，ddH2O沖洗玻片，直至流出的水無色為止，用0.5 %番紅溶液復染3 min，使用洗耳球吹去多余染液，吹干玻片。油鏡下芽孢呈綠色，菌體呈紅色。分別計數10個單獨的視野。產芽孢率= 芽孢數/（ 芽孢數+ 營養細胞數）×100 %。

2 結果

2.1 艱難梭菌spo0Aspo0A突變株驗證

用Cd-spo0A-F1/Cd-spo0A-R1引物進行PCR后，瓊脂糖凝膠電泳顯示突變株擴增產物的長度較親代株長，測序結果證實該段序列中含有Ⅱ類內含子。用ErmRAM-F/ErmRAM-R引物PCR后其測序結果證實了RAM片段在突變過程中發生重組。用插入序列一端引物EBS Universal和spo0A基因一端引物Cd-spo0A-R1進行PCR后結果則進一步證實了spo0A基因中有內含子插入序列，突變株構建成功，見圖1。

圖1 艱難梭菌spo0A突變株驗證Figure 1 PCR conf rmation of intron integration into spo0A gene

2.2 生長曲線

以實驗室標準菌株VPI10463為對照，可見VPI10463、C25與C25 spo0A突變株生長情況相似，在前9 h均處于指數生長期，12 h后進入穩定生長期。各個時間點C25與C25 spo0A突變株菌液濃度也相仿，見圖2。

圖2 VPI10463， C25， C25 spo0A突變株生長曲線Figure 2 Growth curve of three Clostridium diff cile strains, VPI10463, C25 and C25 spo0A mutant

2.3 產芽孢率

VPI10463在48 h即開始有芽孢產生，產芽孢率0.3 %，而后隨時間增長產芽孢率增加。C25菌株在48 h開始有芽孢產生，產芽孢率0.1 %，而后隨時間增長產芽孢率亦增加。但C25 spo0A突變株至120 h均沒有芽孢產生，見圖3。

圖3 spo0A基因對芽孢產生的影響Figure 3 Effect of spo0A gene inactivation on sporulation capacity of C. diff cile

3 討論

艱難梭菌作為一種芽孢桿菌，可在惡劣的條件下產生芽孢，臨床上營養缺乏、抗生素暴露、消毒劑的使用均可能使之產生芽孢。因此芽孢是艱難梭菌傳播的主要形式，亦可能與艱難梭菌感染停藥后反復發作相關[8]。文獻報道歐美廣泛傳播的NAP1/BI/027菌株產芽孢能力明顯高于其他菌株，且該菌株感染更容易復發[9]。因此當前很多研究者對艱難梭菌芽孢形成機制進行研究，以期為治療艱難梭菌感染提供新靶點和新思路。

Spo0A是近年來研究的熱點之一，其在營養細胞生長、芽孢產生、毒素分泌以及生物膜形成方面的作用均有報道[10]。但由于在艱難梭菌中基因敲除比較困難，因此基因功能研究明顯落后于其他病原菌，直至2007年Nigel Minton教授研發并共享ClosTron技術[11]。本課題組亦是在Nigel Minton惠贈關鍵質粒后方成功敲除spo0A基因。

本研究發現spo0A基因敲除前后突變菌株與親代菌株的生長趨勢相仿，均在9 h后進入穩定生長期，且各個生長階段吸光度值D600均相近，表明spo0A基因并非艱難梭菌C25菌株生長過程中的主要基因。雖Pettit等[6]研究顯示部分與細胞壁合成相關的基因也受Spo0A調控，但敲除spo0A基因對于艱難梭菌營養細胞的生長并無明顯影響。

本研究中艱難梭菌臨床分離株C25和實驗室標準菌株VPI10463在TY肉湯中培養48 h即開始產生芽孢，之后隨著培養時間的延長產芽孢率明顯增加，但C25 spo0A突變株在整個研究階段均無芽孢產生，提示Spo0A是艱難梭菌芽孢產生的必要蛋白。這與其他研究者的結果相一致：Mackin等[12]、Underwood 等[7]和Deakin等[5]對spo0A基因敲除后的027、 078、630 Δerm的研究均發現spo0A基因敲除后突變株不產生芽孢。并且Deakin等[5]還發現spo0A基因敲除后突變株在小鼠中的傳播和持續感染均受到影響，可能與spo0A基因敲除后艱難梭菌芽孢產生障礙有關。

本研究的局限在于未進行spo0A基因回補試驗，且僅敲除核糖體型014菌株。今后將增加不同核糖體型別的研究菌株，特別是國內主要的核糖體型017流行株；增加回補實驗及動物實驗，為了解Spo0A在艱難梭菌感染發病和傳播中的作用提供更多依據。

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The role of spo0A gene in growth and sporulation of Clostridium diff cile

SONG Xiaolei, ZHOU Fenfen, WU Shi, GAO Qiong, HUANG Haihui, CHEN Yijian. （Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University; Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai 200040, China）

Objective To investigate the role of spo0A gene in growth and sporulation of Clostridium diff cile clinical isolates. Methods ClosTron gene knock-out system was used to knock out the spo0A gene of C. difficile strain C25. Bacterial growth curve was plotted by measuring D600with spectrophotometer in different phases of bacterial growth. Malachite green staining technique was used to count the number of vegetative cells and spores under optical microscope. The sporulation rate was calculated. Results The spo0A mutant and its C25 parental strain showed similar patterns of growth. However, after knock-out of spo0A gene, an asporogenous phenotype was built, while the parental strain could produce spores as usual. Conclusions The spo0A gene plays a key role in sporulation but not growth of C. diff cile strain.

Clostridium diff cile; sporulation; spo0A gene; growth curve

R378.8

A

1009-7708 ( 2017 )01-0033-04

10.16718/j.1009-7708.2017.01.006

2016-07-13

2016-07-20

國家自然科學基金項目(30973594)。

復旦大學附屬華山醫院抗生素研究所，衛生部抗生素臨床藥理重點實驗室，上海 200040。

宋曉蕾（1988—），女，碩士研究生，主要從事感染性疾病的診斷治療。

陳軼堅，E-mail：chenyijian@fudan.edu.cn。