應用碳青霉烯酶失活法檢測產碳青霉烯酶鮑曼不動桿菌

牛 翠， 楊 靖， 時東彥

·論著·

應用碳青霉烯酶失活法檢測產碳青霉烯酶鮑曼不動桿菌

牛 翠1， 楊 靖2， 時東彥2

目的 評估碳青霉烯酶失活法（carbapenem inactivation method，CIM）試驗檢測耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌產生碳青霉烯酶的能力。方法 收集121株鮑曼不動桿菌，應用全自動細菌鑒定儀進行菌株鑒定和藥敏試驗，CIM檢測鮑曼不動桿菌所含碳青霉烯酶，應用PCR方法檢測OXA-23型碳青霉烯酶基因。結果 121株鮑曼不動桿菌中68株對亞胺培南和美羅培南耐藥，其中65株菌PCR顯示攜帶OXA-23基因，66株菌CIM試驗為陽性。52株鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南均敏感，其中49株菌OXA-23陰性，52株菌CIM試驗全為陰性。1株菌對亞胺培南耐藥、對美羅培南敏感，CIM試驗陰性，OXA-23陽性。CIM試驗的敏感性和特異性分別為94.2% 和 98.1%。結論 與PCR方法相比較CIM試驗操作簡便，成本小，結果易讀，易于在實驗室開展。應用CIM試驗可以檢測鮑曼不動桿菌OXA-23型碳青霉烯酶，

鮑曼不動桿菌； 碳青霉烯酶失活法； OXA-23型碳青霉烯酶

鮑曼不動桿菌因其導致醫院感染和在重癥患者間的傳播越來越被關注[1]。在過去10年，對碳青霉烯類藥物耐藥的鮑曼不動桿菌的比例越來越高，成為治療該菌感染的嚴重挑戰[2]。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因是產碳青霉烯酶，其次為膜孔蛋白的缺失或下降導致膜通透性的減低，青霉素結合蛋白的改變等[3]。因此快速檢測鮑曼不動桿菌是否含有碳青霉烯酶可以為臨床及時治療提供有效的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 選擇河北醫科大學第二醫院2015年5－6月和邢臺市第三醫院2014年1月－2015年6月從臨床標本分離鮑曼不動桿菌菌株121株，剔除同一患者同一部位分離菌，全部菌株均采用VITEK 2-Compact全自動細菌鑒定藥敏儀進行驗證。菌株采用無菌紙片-20 ℃保存。選取肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705碳青霉烯酶陽性對照質控菌株，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706碳青霉烯酶陰性對照質控菌株，藥敏質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922

1.1.2 儀器與試劑 VITEK 2全自動細菌鑒定儀（法國生物梅里埃公司產品）；血瓊脂平皿（鄭州安圖生物工程股份有限公司 ）；美羅培南10 μg藥敏片（康泰生物制品有限公司提供）；Muller-Hinton藥敏培養平皿（廣州市迪景微生物科技有限公司）；GeneAmpPCRsystem 2400熱循環儀（美國Applied Biosystems Inc.）；DNA Marker DL2000（大連TaKaRa公司）；瓊脂糖（美國Hydra Gene公司）；Goldviw（北京賽百盛生物技術公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和藥敏試驗 經VITEK 2-Compact全自動細菌鑒定儀進行鑒定和藥敏試驗，按照2015年的美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）的標準來判定鮑曼不動桿菌的耐藥情況。

1.2.2 菌株復蘇 從-20 ℃保存的菌株庫找到相應菌株，確認無誤后，用LB液體培養液進行振蕩復蘇，然后接種到血瓊脂培養基上進行培養。

1.2.3 PCR擴增 DNA模板的制備：采用煮沸法，挑取在血培養上孵育18～24 h的數個菌落加入到有滅菌蒸餾水150 μL的EP管中，煮沸10 min后立即冷卻于4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為PCR模板。OXA-23-F 5'GATCGGATTGGAG AACCAGA OXA-23-R 5'ATTTCTGACCGCATTT CCAT。目的片段501 bp。PCR反應條件為預變性 95 ℃ 2 min，循環參數：變性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，共循環30次，延伸72 ℃ 10 min。取6 μL PCR產物用含Goldview染料的1.5 %瓊脂糖凝膠上電泳。然后在紫外成像儀上成像并記錄結果。

1.2.4 碳青霉烯酶失活法（carbapenem inactivation method，CIM）[4]經LB培養基復蘇過的鮑曼不動桿菌在血培養基上經過35 ℃過夜培養后，用10 μL接種環挑取滿環加入到400 μL高壓滅菌的蒸餾水中。振蕩混勻后，加入10 μg美羅培南藥敏片。35 ℃溫育4 h后，在MH藥敏平皿上均勻涂布0.5麥氏濁度的大腸埃希菌ATCC 25922，放置10 min后，將溫育好的美羅培南藥敏片取出，貼壁擠去多余的液體，貼到MH平皿上。35 ℃溫育過夜觀察結果。如果藥敏片周圍無抑菌環，則為陽性（產碳青霉烯酶），如果藥敏片周圍形成抑菌環，則為陰性（不產碳青霉烯酶）。

2 結果

2.1 細菌耐藥情況

121株鮑曼不動桿菌中68株對亞胺培南和美羅培南均耐藥，52株對亞胺培南和美羅培南均敏感。僅1株對亞胺培南耐藥、對美羅培南敏感。

2.2 PCR檢測基因結果

121株鮑曼不動桿菌中PCR檢測OXA-23 基因陽性69株，IMP、NDM、VIM、KPC基因檢測均陰性。

2.3 耐藥表型與OXA-23的關系3

121株鮑曼不動桿菌中，68株對亞胺培南和美羅培南均耐藥，其中65株菌PCR顯示攜帶OXA-23基因；52株鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南均敏感，其中3株菌攜帶OXA-23基因；1株對亞胺培南耐藥、對美羅培南敏感，OXA-23為陽性。見表1。

表1 OXA-23的結果和耐藥性分析Table 1 Resistant pattern and corresponding result of OXA-23 gene detection

2.4 CIM 檢測結果與耐藥表型分析

68株亞胺培南和美羅培南耐藥鮑曼不動桿菌中，66株菌CIM試驗呈陽性。52株亞胺培南和美羅培南敏感的菌株中，CIM全部呈陰性。1株亞胺培南耐藥但美羅培南敏感菌株，CIM試驗呈陰性。見表1。

2.5 CIM和OXA-23的結果比對

以OXA-23為標準，CIM陽性檢測能力為65/69，陽性預測值為94.2 %，陰性檢測能力為51/52，陰性預測值為98.1 %

3 討論

由鮑曼不動桿菌導致的醫療相關感染（HAI），經常發生在病情非常嚴重的患者，鮑曼不動桿菌所致HAI可以將患者病死率從4 %增加到40 %[5]，特別是幸存的鮑曼不動桿菌獲得了對多種藥物耐藥的能力。在我國臺灣，耐藥率從2003年的14 %上升到了2008年的46 %[6]。中國細菌耐藥監測網（CHINET）報道2014年不動桿菌屬（鮑曼不動桿菌占93.0 %）對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為62.4 %和66.7 %[7]，在我省據河北省細菌耐藥監測網2013年數據統計表明耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為70.9 %和78.2 %[8]。高耐藥率的鮑曼不動桿菌已經蔓延全球，特別是亞太地區和拉丁美洲， 治療由鮑曼不動桿菌引起感染的抗菌藥物選擇越來越困難。

碳青霉烯類抗生素，經常被最后用來治療多重耐藥的革蘭陰性桿菌，然而，隨著過度使用碳青霉烯類抗生素，細菌對這類藥物產生耐藥，主要耐藥機制是膜孔蛋白的缺失或下降導致膜通透性的降低；青霉素結合蛋白的改變；產碳青霉烯酶。尤以后者為主要的耐藥機制[3]。由染色體介導低水平表達的OXA-51是其固有耐藥基因，一般不會導致對碳青霉烯類抗生素耐藥，但是如果在OXA-51基因上游插入ISAbal或者是ISAba9序列，會出現過度表達，從而對碳青霉稀類藥物耐藥[9]。在獲得的碳青霉烯酶中，OXA群基因在全球最為普遍，在鮑曼不動桿菌中，有5大群OXA類碳青霉烯酶，包括OXA-23、 -40、 -58、 -143和-235群。這些基因本身對碳青霉烯類耐藥影響比較小，但是當ISAbal. ISAba2. ISAba3. ISA18等在這些（除blaOXA24）基因的上游時使這些酶的表達量增加，導致對碳青霉烯類耐藥。其中OXA-23群是鮑曼不動桿菌最為普遍的耐藥基因[10]。本研究中，有68株對亞胺培南和美羅培南均耐藥，其中65株OXA-23基因陽性，說明我們2所醫院的鮑曼不動桿菌的主要碳青霉烯酶的基因型為OXA-23。

PCR是碳青霉烯酶基因檢測的“金標準”，可以精確鑒定碳青霉烯酶的種類。目前直接進行碳青霉烯酶基因檢測的技術有普通PCR、實時熒光定量PCR、多重PCR、環介導等溫擴增（LAMP）、基因芯片等。PCR 缺點是成本較高，需要高的專業技能，只能檢測已經確定的基因。CIM試驗是由van der Zwaluw等[4]首先使用的一種新型的碳青霉烯酶表型檢測方法。可以用來檢測腸桿菌科細菌、不發酵糖革蘭陰性桿菌（銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌）是否產碳青霉烯酶。其原理是美羅培南由于碳青霉烯酶的水解作用而滅活，從而無法抑制大腸埃希菌ATCC 25922的生長。該方法成本低，實用性強，操作簡單，不需要專業的設備和技能，而且不受細菌培養時間、藥敏片孵育時間、藥敏片生產廠商以及細菌是否產黏液的影響，結果易于解釋。但是結果中抑菌環直徑的大小是否與結果有關，有待探討。Tijet等[11]應用此技術檢測后發現抑菌環直徑20 mm和6 mm，對結果解釋無影響。本研究抑菌環直徑大小在24～14 mm，盡管本研究未發現有不一致的結果，但是抑菌環直徑仍然是一個需要探討的問題。

本研究中，共檢測121株鮑曼不動桿菌，其中有68株對亞胺培南和美羅培南均耐藥，65株CIM和OXA-23均為陽性；2株CIM和OXA-23均為陰性，有可能是由于其他耐藥機制如產AmpC酶或者超廣譜β內酰胺酶（ESBL）、外膜通透性下降等原因造成的；1株CIM陽性，OXA-23陰性，盡管本研究同時檢測了IMP、NDM、VIM、KPC基因，但是未見陽性，推測有可能是產其他類的碳青霉烯酶。有52株鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南均敏感，其中49株CIM和OXA-23為陰性。1株鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥、對美羅培南敏感，CIM陰性，OXA-23陽性；3株鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南均敏感，CIM陰性，OXA-23陽性，考慮到有可能是CIM試驗使用的菌的濃度或者藥敏紙片的選擇問題，重復試驗后CIM仍然是陰性，加大菌液的濃度，把美羅培南紙片更換為亞胺培南紙片后試驗結果仍然是陰性，考慮可能是由于OXA-23酶活性比較弱。

本研究結果表明CIM的靈敏度和特異度分別達到了94.2 %和98.1 %，從方法評價應該是非常好的方法。本方法比PCR方法操作簡單、消耗低、干擾因素少、結果易于解釋等優點可以作為普通實驗室篩查鮑曼不動桿菌是否產碳青霉烯酶的表型方法。在抗感染形勢日趨嚴重的今天，快速而有效地診斷能夠為臨床及時應用及調整抗生素提供快速有效的依據。

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Application of carbapenem inactivation method in detection of carbapenemaseproducing Acinetobacter baumannii

NIU Cui, YANG Jing, SHI Dongyan. （Department of Laboratory Medicine, the Third Hospital of Xingtai, Xingtai Hebei 054000, China）

Objective To evaluate the utility of carbapenem inactivation method (CIM) in detecting carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii. Methods A total of 121 strains of A. baumannii were identified and subjected to antimicrobial susceptibility testing by VITEK compact. Carbapenem inactivation method (CIM) was applied to detect the carbapenemase in the A. baumannii strains. The OXA-23 type carbapenemase-encoding genes were analyzed by common PCR method. Results Six-eight of the 121 strains showed resistance to imipenem and meropenem. PCR showed that 65 of the 68 strains carried OXA-23 gene. CIM was positive in 66 of the 68 strains. And 52 of the 121 A. baumannii strains were susceptible to imipenem and meropenem. PCR showed that OXA-23 gene was negative in 49 of the 52 strains. CIM was negative in the 52 strains of non-carbapenemase-producing A. baumannii. Only one strain was resistant to imipenem but susceptible to meropenem. CIM was negative but QXA-23 was positive for this strain. The sensitivity and the specif city of CIM was 94.2% and 98.1% respectively in detecting carbapenemase-producing A. baumannii. Conclusions The results of CIM were consistent with the results obtained by PCR to detect the encoding gene of OXA-23. CIM is inexpensive, easier to operate and interpret than PCR method. CIM is applicable to detect OXA-23 type carbapenemase rapidly in A. baumannii.

Acinetobacter baumannii; carbapenem inactivation method; OXA-23 type carbapenemase

R378.99

A

1009-7708 ( 2017 ) 01-0052-04

10.16718/j.1009-7708.2017.01.010

2016-01-20

2016-04-10

1. 邢臺市第三醫院檢驗科，河北邢臺 054000；

2. 河北醫科大學第二醫院檢驗科。

牛翠（1985—），女，碩士研究生，主管檢驗師，主要從事細菌學專業。

時東彥，E-mail: shidongyan73@126.com。