硫酸鋅對血管內皮細胞氧化應激保護作用的研究①

劉 佳 李肖楠 孫思銘 王越暉

(吉林大學第一醫院老年病科，長春130041)

·基礎免疫學·

硫酸鋅對血管內皮細胞氧化應激保護作用的研究①

劉 佳 李肖楠 孫思銘②王越暉

(吉林大學第一醫院老年病科，長春130041)

目的：研究硫酸鋅對體外培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)氧化應激的保護作用。方法：用過氧化氫(H2O2)建立血管內皮細胞氧化應激損傷模型， 觀察正常對照組、H2O2組、硫酸鋅組及硫酸鋅治療組各組細胞的各項指標。采用硝酸還原酶法測定細胞培養液中一氧化氮(NO)，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定培養液中內皮素(ET)含量，用蛋白免疫印跡技術(Western blot)檢測細胞的血紅素加氧酶(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)水平，用末端標記法(TUNEL)檢測HUVEC的凋亡情況。結果：硫酸鋅能顯著提高H2O2誘導的HUVEC培養液中的NO含量，降低ET含量，提高細胞HO-1、SOD和CAT水平，減少H2O2誘導的內皮細胞凋亡數量。結論：硫酸鋅具有較強對抗內皮細胞氧化應激的能力，并具有一定預防作用，硫酸鋅有望成為提高HUVECs抗氧化損傷能力的有效藥物。

氧化應激；硫酸鋅；過氧化氫；內皮細胞

血管內皮細胞的改變與諸多疾病的發生和發展密切相關，許多疾病早期即存在血管內皮功能的失調，而內皮細胞功能障礙是糖尿病血管并發癥的始動因素和中心環節[1]。氧化應激是糖尿病血管內皮功能障礙的重要原因之一[2]，氧化應激早在糖耐量異常時就已經出現，隨著糖代謝異常的加重，氧化應激損傷也與之成正比，從而引起微血管和大血管病變，進而導致糖尿病發病率和死亡率的顯著增加[3]。因此，尋找合適的抗氧化應激保護血管內皮細胞的藥物，對預防和治療糖尿病心血管并發癥有著重要意義。

鋅(Zn)作為人體必需的微量元素之一，有許多生物功能。Zn參與胰島素的合成、分泌，調節胰島素的生物活性和抗原性，因此，Zn與糖尿病的發生、發展及并發癥的發生都密切相關[4]。Zn亦可作為多種酶和蛋白質的輔助因子參與抗氧化作用[5]。我們前期研究發現，老年2型糖尿病患者血清離子紊亂，其中鋅離子、鎂離子在糖尿病組患者血清中明顯下降，氧化損傷明顯增加，內皮功能顯著受損。目前的研究結果提示我們，給糖尿病患者尤其是老年糖尿病患者補充Zn可能緩解糖尿病及其相關的血管并發癥[6]。因此，本文研究目的在于探討鋅是否具有抵抗氧化應激發揮保護血管內皮的作用，為防治糖尿病心血管并發癥提供研究基礎。本研究用H2O2誘導的HUVEC建立氧化應激損傷細胞模型，觀察和評價了硫酸鋅對內皮細胞氧化應激損傷的預防和治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVEC是購自Biosun公司，牛血清(FBS)及Trypsin-EDTA(1×)(濃度0.25%)均購自Gibco公司，倒置顯微鏡(CKX)為日本Olympus，NO及ET檢測試劑盒均購自凱基公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自公司YEASEN，HO-1、SOD和CAT抗體購自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 將細胞培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，置37℃，5%CO2飽和濕度培養箱內常規培養，待細胞傳代3～6代至穩態后，將細胞3×105ml-1濃度均勻鋪于6孔板內，培養24 h后，分為4組：①正常對照組：不加H2O2處理；②硫酸鋅組：加硫酸鋅組(終濃度為50 μmol/L)；③H2O2造模組：加H2O2處理(終濃度為250 μmol/L)；④硫酸鋅治療組：加H2O2和硫酸鋅(H2O2終濃度為250 μmol/L+硫酸鋅終濃度為50 μmol/L) ；每次檢測每組設6個復孔，置于37℃，5%CO2飽和度恒溫培養箱內常規培養24 h后開始實驗。

1.2.2 NO含量的測定 將細胞按照上述分組方法進行培養，分別收集細胞上清液，采用NO檢測試劑盒(KGT00725-KGT00750)，應用硝酸還原酶法，依照試劑盒中描述的實驗方法和步驟，檢測HUVCE上清液中NO濃度。

1.2.3 ET含量的測定 將細胞按照上述分組方法進行培養，分別收集細胞上清液，應用ELISA法，按照ET檢測試劑盒中描述的實驗方法和步驟，檢測HUVEC上清液中ET濃度。

1.2.4 細胞凋亡情況的測定 接種于6孔板中的細胞按上述分組方法進行培養，將已爬好細胞的爬片用500 μl PBS浸洗1次，時間1 min ；加入4% 的多聚甲醛固定爬片15 min ，用0.5% Triton X-100(PBS配置) 200 μl室溫通透20 min。清洗爬片后，加入100 μl DNA酶Ⅰ室溫孵5 min，并用去離子水洗3～4次，按照TUNEL試劑盒說明書描述進行細胞染色，在熒光顯微鏡下分析樣本，在651 nm下檢測Alexa Fluor 647紅色熒光來檢測細胞凋亡。

1.2.5 免疫蛋白電泳 胰酶消化分組培養的細胞，用PBS沖洗2次，收細胞懸液于1.5 ml EP管中，加入4℃ 預冷蛋白裂解液7.6 ml ，冰上裂解30 min ；4℃ 離心，13 200 r/min，15 min ；收取細胞裂解液。將玻璃板洗干凈，固定于電泳槽上，經過加樣、電泳后，將蛋白質從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉移至固相支持體，用5%脫脂奶粉 (TBST配制)，封閉。平放于搖床平臺上，室溫溫育1～2 h后取出膜在TBST中洗滌1次；將膜放入可加熱封接的塑料袋中，分別加入SOD、CAT、HO-1(工作濃度1∶100)一抗，4℃過夜。取出膜在TBST中洗滌每次10 min，共3次；將膜放入可加熱封接的塑料袋中，根據說明書加入適當濃度的二抗，室溫溫育2 h。ECL發光檢測，在暗室用X線片曝光，顯影、定影后觀察結果。

2 結果

2.1 硫酸鋅對不同分組的內皮細胞NO含量的影響 分別對正常對照組(HUVEC)，H2O2造模組(HUVEC+ H2O2),硫酸鋅組(HUVEC+ZnSO4)及硫酸鋅治療組(HUVEC+ H2O2/ZnSO4)內皮細胞培養基中的NO含量進行測定，結果發現，在H2O2造模組，NO含量顯著降低，ET含量明顯升高，與正常對照組、硫酸鋅組及硫酸鋅治療組相比有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 硫酸鋅對不同分組的內皮細胞NO表達的影響Fig.1 Effects of Zinc sulfate on NO expression in different HUVECs groupsNote: *.vs HUVEC,P<0.01; #.vs HUVEC+ZnSO4,P<0.01;△.vs HUVEC+H2O2/ZnSO4,P<0.01，n=6.

圖3 硫酸鋅對不同分組的內皮細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Zinc sulfate on apoptosis in different HUVECs groups

圖4 硫酸鋅對不同分組的內皮細胞SOD、CAT及HO-1蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Zinc sulfate on SOD,CAT,HO-1 protein expression of different HUVECs groupsNote: H2O2 vs control,*.P<0.01;H2O2 vs ZnSO4,#.P<0.05;H2O2 vs H2O2/ZnSO4,△.P<0.05.

圖2 硫酸鋅對不同分組的內皮細胞ET表達的影響Fig.2 Effects of Zinc sulfate on ET expression in different HUVECs groupsNote: vs HUVEC,*.P<0.01;vs HUVEC+ZnSO4,#.P<0.01;vs HUVEC+H2O2/ZnSO4,△.P<0.01，n=6.

2.2 硫酸鋅對不同分組的內皮細胞ET含量的影響 分別對正常對照組(HUVEC)，H2O2造模組(HUVEC+ H2O2)、硫酸鋅組(HUVEC+ZnSO4)及硫酸鋅治療組(HUVEC+ H2O2/ZnSO4)內皮細胞培養基中的ET含量進行測定，結果發現，在H2O2造模組， ET含量明顯升高，與正常對照組、硫酸鋅預防組及硫酸鋅治療組相比有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

2.3 TUNEL試劑盒檢測內皮細胞凋亡變化 在熒光顯微鏡下分析樣本，在651 nm下檢測Alexa Fluor 647紅色熒光，只在凋亡的細胞核中才有Alexa Fluor 647-12-dUTP摻入而定位的紅色熒光，TUNEL染色結果顯示加入H2O2孵育24 h的細胞組中大量細胞破碎、皺縮，同時加入硫酸鋅和H2O2細胞組被染成紅色的細胞較H2O2組減少，只加入硫酸鋅的細胞組中極個別的細胞被染成紅色，發生凋亡(見圖3)。

2.4 硫酸鋅對細胞內HO-1、SOD和CAT表達情況的影響 免疫蛋白電泳結果顯示：加入H2O2處理的細胞組與正常對照組相比，SOD、CAT、HO-1蛋白表達量明顯減少(P<0.01)；與加入H2O2同時用硫酸鋅處理的細胞較H2O2處理組細胞在SOD、CAT、HO-1表達有明顯提高，二者之間差異顯著(P<0.05)，見圖4。

3 討論

內皮功能障礙不僅是動脈粥樣硬化發病機制中的早期關鍵因素[7]，也是糖尿病血管并發癥的始動因素和中心環節[1]，因此對抗內皮細胞氧化應激造成的細胞凋亡、細胞損傷，改善內皮細胞功能障礙是防治糖尿病及其并發癥發生、發展的有效治療手段。

鋅是人體非常重要的微量元素，攝入量雖少，但與糖尿病的發生、發展及并發癥的發生都密切相關[4]。研究表明，鋅離子具有抗氧化、抗凋亡及維持膜穩定性的作用，通過維持血管內皮的完整性來保護血管內皮對抗氧化應激[8，9]。鋅在胰島β細胞中參與了胰島素的生成、儲存和分泌[4]。研究發現老年糖尿病患者補充Zn可能緩解糖尿病及其相關的血管并發癥[6]。因此，本實驗主要通過H2O2建立氧化應激細胞損傷模型模擬糖尿病狀態下對血管內皮的氧化應激損傷，進而研究硫酸鋅對血管內皮損傷的保護作用。

NO是血管內皮釋放的最重要的血管舒張因子之一，對于維持內皮細胞的完整性和平衡性非常重要[10]。ET是廣泛存在于各種組織和細胞中調節心血管功能的重要因子，ET-1水平則反映了內皮細胞的損傷程度，對維持血管系統穩態也發揮重要作用[11]。

當血管內皮的穩態被破壞后，血管內皮細胞分泌的多種活性因子，如NO、ET等，改變血管的緊張度和血液中白細胞、血小板及內皮細胞的相互作用，導致血管舒縮功能障礙和啟動內皮炎癥網絡系統引發內皮細胞功能障礙，進而引發心血管疾病，因此，內皮功能障礙已成為心血管疾病的一個重要靶點[10,11]。高糖條件下血管活性因子含量的失衡可致血管內皮損傷，進而促進糖尿病血管并發癥的發生[12]。

本研究對內皮細胞上清液中NO、ET含量測定，發現上清液中NO含量降低、ET含量增加，NO水平降低將導致血管收縮，ET導致內皮細胞功能障礙。而硫酸鋅可以提高內皮細胞培養上清中NO水平，減少ET的分泌，說明硫酸鋅可以顯著對抗H2O2產生的氧化應激損傷，從而發揮保護內皮細胞的作用。

氧化應激主要來源于抗氧化組織破壞增加及自由基生成增多，打破機體的氧化與抗氧化平衡，機體便會產生氧化應激損傷[3]。SOD、CAT、HO-1是細胞內的抗氧化劑，本研究發現，與H2O2組細胞相比，加入硫酸鋅的細胞SOD、CAT、HO-1表達明顯增加，結果表明硫酸鋅可以清除細胞內自由基，上調氧化防御系統活性，對抗氧化應激損傷，發揮對內皮細胞的保護作用 。

高糖誘導內皮細胞凋亡與脂肪酸代謝的變化、線粒體功能障礙、細胞凋亡蛋白酶-3的激活及胰島素激活蛋白激酶能力的下降有關[13]。我們研究發現，H2O2組細胞較正常對照組細胞凋亡率顯著增加，加入硫酸鋅后，細胞凋亡率顯著降低，說明細胞模型系統中增加鋅離子濃度能顯著對抗氧化應激造成的細胞凋亡，提高細胞存活率。

綜上所述，本文通過H2O2建立對臍靜脈內皮細胞氧化應激損傷模型，模擬糖尿病患者體內高糖對血管內皮的損傷，研究硫酸鋅對血管內皮氧化應激損傷條件下的治療及預防作用。實驗結果發現，硫酸鋅能顯著對抗細胞內氧化應激，促進損傷細胞內NO分泌，抑制ET分泌，維持血管收縮和舒張的平衡，提高各種抗氧化劑如SOD、CAT、HO-1在體內的活性，進而上調體內抗氧化系統的活性，清除過多自由基，降低細胞凋亡率，保護血管內皮細胞。我們的研究證實了鋅對血管內皮細胞的保護作用。研究結果提示我們，補鋅可能會改善糖尿病患者氧化應激狀態，通過補鋅的輔助治療可能在一定程度上減緩糖尿病及糖尿病并發癥進展，為糖尿病患者的治療和預后帶來了新的前景。

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[收稿2016-12-13 修回2017-01-03]

(編輯 倪 鵬)

Effects of Zinc sulfate on preventing vascular endothelial cells from oxidative stress

LIUJia,LIXiao-Nan,SUNSi-Ming,WANGYue-Hui.

DepartmentofGeriatrics,theFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China

Objective:To investigate the effects of Zinc sulfate on preventing human umbilical veins endothelial cells (HUVECs) from oxidative stress.Methods: Hydrogen peroxide was used to stimulate HUVECs to build the oxidative stress model in vitro.HUVECs were divided into normal group,H2O2group,Zinc sulfate group and Zinc sulfate treated group.Method of nitrate reductase was used to detect the content of nitric oxide(NO) and ELISA was used to detect the content of endothelin(ET) in supernatant in different groups.The level of HO-1，SOD and CAT of HUVECs were measured by Western blot.Apoptosis of HUVECs was examined by TUNEL as well.Results: Zinc sulfate could enhance the content of NO and decrease the content of ET in the supernatant,which induced by hydrogen peroxide on HUVECs.Zinc sulfate could also increase the level of HO-1，SOD and CAT obviously and decrease the apoptosis cells significantly induced by H2O2.Conclusion: Zinc sulfate play an important role in resisting oxidative stress in HUVECs,and maybe prevent HUVECs from oxidative stress damage.Zinc sulfate is expected to be an effective medicine on improving endothelial cells anti-oxidative ability.

Oxidative stress；Zinc sulfate；Hydrogen peroxide；Endothelial cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.002

①本文受國家自然基金項目(81671378,81470061)和吉林省科技廳中青年科技創新領軍人才及團隊項目(20140519012JH)資助。

劉 佳(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事糖尿病內皮功能方面研究，E-mail:412132123@qq.com。

及指導教師：王越暉(1970年-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事糖尿病心血管并發癥發病機制與防治方面的研究，E-mail: yuehuiwang300@hotmail.com。

R453.9

A

1000-484X(2017)02-0170-04

②吉林農業大學生命科學學院，長春130118。