紅樹林淡紫擬青霉胞外多糖對小鼠DCs表型成熟的影響①

胡海巖 王華民 林英姿 常彩紅 楊 文 王永霞

(海南醫學院臨床學院，海口571109)

紅樹林淡紫擬青霉胞外多糖對小鼠DCs表型成熟的影響①

胡海巖 王華民②林英姿②常彩紅②楊 文②王永霞②

(海南醫學院臨床學院，海口571109)

目的：探討紅樹林來源的淡紫擬青霉胞外多糖對小鼠骨髓源性樹突狀細胞(DCs)表型成熟的影響。方法：從小鼠骨髓腔中分離獲得單核細胞，加入細胞因子rmGM-CSF、rmIL-4 誘導分化為未成熟DCs并用不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖干預，流式細胞術檢測成熟DCs的表面標志CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86分子的表達及吞噬FITC-dextran 的能力，ELISA檢測該多糖對DCs分泌IL-12的影響；MTT法檢測該多糖對DCs刺激T細胞增殖的影響。結果：經400 μg/ml多糖作用48 h后DCs 表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86的表達顯著上調，與空白對照組相比P<0.01，與LPS組相比P>0.05；經該多糖作用后DCs吞噬FITC-dextran的能力下降，尤其300 μg/ml 、400 μg/ml的多糖作用效果最明顯，與空白對照組相比P<0.05；該多糖還可刺激DCs分泌IL-12，尤其100～400 μg/ml的多糖刺激作用較強，與空白對照組相比P<0.05；另外，經該多糖處理的DCs還可刺激T細胞增殖，將不同比例刺激細胞與T作用后均可見T細胞增殖，與空白對照組相比P<0.05。結論：淡紫擬青霉胞外多糖可上調DCs表面 CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86分子表達，降低其吞噬能力，促進其分泌IL-12，還可刺激T細胞增殖，初步表明該多糖可刺激DCs分化成熟。

胞外多糖;淡紫擬青霉；樹突狀細胞；表型；成熟

樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)作為功能最強的抗原提呈細胞，其最大特點是能夠顯著刺激初始T細胞活化，啟動適應性免疫應答[1-3]，人和動物體內的DCs包括成熟和未成熟兩種狀態，未成熟DC由于高表達Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)等抗原識別受體[4]，攝取抗原的能力強，但活化T細胞的能力弱；病原體或其他刺激可活化DCs，使其分化成熟，成熟DCs攝取抗原能力減弱，但由于高表達MHCⅡ、CD86、CD80等分子，提呈抗原的能力及活化T細胞的能力增強[5,6]。因此，通過調控體內DCs的成熟狀況，可改變機體的免疫功能狀態，達到預防或治療疾病的目的。

課題組前期從海南紅樹林中分離鑒定出一株淡紫擬青霉，其產生的胞外多糖體外實驗證實有較好的免疫調節作用，可促進小鼠吞噬細胞的吞噬功能及T淋巴細胞分泌細胞因子的作用[7]。本研究在前期研究的基礎上探討淡紫擬青霉胞外多糖對以小鼠骨髓源性DCs成熟及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6～8周齡BALB/c小鼠，雄性，由本校實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑及藥物 淡紫擬青霉胞外多糖由本室獲得，用雙蒸水配成20 g/L母液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存。APC標記的抗小鼠CD11c單克隆抗體、PE標記的抗小鼠MHCⅡ單克隆抗體、PE標記的抗小鼠CD80單克隆抗體、FITC標記的抗小鼠CD86單克隆抗體及FITC-dextran購自美國Ebioscience公司。RPMI1640 培養基購自Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，陽性對照多糖為脂多糖，購自Sigma公司，絲裂霉素C，購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 流式細胞儀 FACScan(BD 公司)，生物安全柜(SG403A-HE，美國)，酶聯免疫檢測儀(上海天美科學儀器有限公司)，CO2培養箱(NU-4750E，美國)，倒置顯微鏡(深圳拓天儀器設備有限公司)，電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，細胞培養板(Corning,美國)等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來源DCs體外誘導及培養 取6～8周齡BALB/c雄性小鼠40只，SPF級，頸椎脫臼處死，于75%酒精中浸泡10～15 min，無菌手術取出股骨和脛骨，PBS反復沖洗骨髓腔，收集細胞懸液，離心，棄上清。紅細胞裂解液破壞紅細胞，PBS洗3遍后用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液(含10 ng/ml rmGM-CSF和10 ng/ml rmIL-4)調整細胞濃度至2×106個/ml，以3 ml/孔加入6孔板，37℃、5%CO2培養箱培養，吸附3 h后去除未貼壁細胞，重新加入完全培養液，隔日半量換液，第6天收集未成熟DCs進行后續實驗。

1.2.2 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs表型的影響 收集未成熟DCs 用RPMI1640維持液配成1×106ml-1細胞懸液，接種12孔板，每孔2 ml。加入不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖，終濃度分別為50、100、200、300 μg/ml，每一濃度設4個復孔，以RPMI1640為陰性對照，繼續培養48 h，隔天換液并觀察細胞形態。收集細胞，洗滌3次，調整細胞濃度為1×106ml-1，加入APC-CD11c、PE-MHCⅡ和PE-CD80、FITC-CD86，4℃染色標記 30 min，洗滌3次，上機檢測。

1.2.3 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs吞噬能力的影響 收集未成熟DCs，調整細胞濃度為1×106ml-1，加入12孔細胞培養板中，每孔2 ml，加入終濃度分別為50、100、200、300、400 μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖，37℃、5%CO2培養箱培養48 h，收集細胞置37℃孵育30 min，加入FITC-dextran，終濃度為1 mg/ml，37℃孵育4 h，4℃作用1 h，流式細胞儀檢測陽性細胞的百分比。

1.2.4 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs分泌細胞因子的影響 無血清培養基將未成熟DCs 配成1×106ml-1細胞懸液，接種于24孔板中，每孔1 ml。加入終濃度分別為50、100、200、300、400 μg/ml多糖，每一濃度設6個復孔，以RPMI1640為陰性對照，37℃、5%CO2培養箱培養,隔天換液并觀察細胞形態，于72 h收集各組上清液，3 000 r/min 10 min去除顆粒和聚合物。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定上清液中IL-12水平。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs刺激T細胞增殖能力的影響

1.2.5.1 反應性T細胞的制備 取6～8周齡BALB/c小鼠，脫臼處死，無菌操作取小鼠脾臟，研磨制備脾細胞懸液，用200目細胞篩過濾，收集細胞懸液，離心，棄上清，加入紅細胞裂解液充分裂解紅細胞，加入無血清1640培養液終止反應，離心洗滌兩次。用含10%小牛血清的培養液(含IL-2 5 ng/ml)調整細胞濃度至1×107ml-1。置37℃、5%CO2培養箱中培養6 h后收集未貼壁細胞作為T細胞備用。

1.2.5.2 刺激細胞的制備 將1×106ml-1未成熟DCs接種于24孔板中，每孔1 ml。加入終濃度分別為50、100、200、300、400 μg/ml淡紫擬青霉胞外多糖，每一濃度設4個復孔，37℃、5%CO2培養箱培養3 d，收集各組細胞為刺激細胞，加入終濃度為25 μg/ml 的絲裂霉素C，37℃、5%CO2培養箱培養30 min，PBS洗2遍，1 500 r/min離心5 min，調整細胞濃度為1×106個/ml。

1.2.5.3 DC與T淋巴細胞的混合培養 將制備好的刺激細胞加入96孔板，每孔100 μl，加入經絲裂霉素C滅活的DCs，T細胞與DCs的比例分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40，每孔終體積為200 μl，每一濃度設6個復孔，同時設單一T細胞對照和空白對照，37℃、5%CO2培養箱培養72 h，吸棄上清。每孔加20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續培養4 h，每孔加150 μl DMSO震蕩10 min，等待結晶物全部溶解后，用酶標儀測570 nm處光密度值(OD)。T細胞增殖率=(實驗孔OD-對照孔OD)/對照孔OD×100%。

2 結果

2.1 小鼠骨髓來源DCs體外誘導及培養 棄除懸浮細胞并更換含有細胞因子的完全培養基后，可見貼壁細胞大小均勻，呈圓形。培養24 h后，出現懸浮細胞，細胞形態未發生明顯變化。培養第3天，可見疏松黏附與貼壁細胞的集落產生，細胞體積變大，形狀不規則。培養第5天，可見細胞集落增多，細胞多呈星狀、蝌蚪狀，有明顯突起。

圖1 倒置顯微鏡下不同時間DCs形態變化Fig.1 Morphologic feature of DCs was photographed in different phases

2.2 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs表型的影響 將不同濃度多糖作用于未成熟DCs 48 h后流式細胞儀檢測表面分子表達情況，發現不同濃度多糖均可刺激DCs CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86分子表達，且在所用濃度范圍內呈劑量依賴性。多糖終濃度為50、100、200 μg/ml時，CD11c、MHCⅡ雙陽性細胞百分率分別為(24.4±1.2)%、(27.1±2.0)%、(33.9±3.5)%，與空白對照組(23.5±0.16)%相比，差異無統計學意義(P>0.05)，與LPS組(53.1±1.5)%相比，差異有統計學意義(P<0.01)，而當多糖終濃度達300、400 μg/ml時CD11c、MHCⅡ雙陽性細胞百分率分別為(42.8±2.6)%、(50.4±1.3)%，與空白對照組相比,差異有統計學意義(P<0.01)，與LPS組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；不同濃度多糖亦可促進DCs CD80和CD86共刺激分子的表達，多糖終濃度為50、100、200、300、400 μg/ml時CD80、CD86雙陽性細胞百分率分別為(29.8±3.1)%、(32.1±1.7)%、(40.3±1.5%)、(50.7±2.4)%、(61.0±0.5)%，其中多糖終濃度300、400 μg/ml 作用下的DCs雙陽性細胞百分率與空白對照組(27.9±1.2)%相比,差異有統計學意義(P<0.01)，400 μg/ml多糖作用下的DCs雙陽性細胞百分率與LPS組(70.2±2.5)%相比，差異無統計學意義(P>0.05)。說明多糖終濃度在400 μg/ml時對DCs分化成熟的刺激作用最好，部分流式結果見圖2。

圖2 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs 表達CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86分子的影響Fig.2 Expression level of CD11c,MHCⅡ,CD80 and CD86 on DCs treated by polysaccharides

圖3 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs吞噬能力的影響流式圖Fig.3 Influence of polysaccharides on DCs phagocytotic ability by flow cytometry

圖4 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs吞噬能力的影響±s)Fig.4 Effect of polysaccharides on phagocytosis of Note: Compared with blank control group，*.P<0.05.

圖5 淡紫擬青霉胞外多糖對IL-12分泌的影響±s)Fig.5 Effects of IL-2 production in culture supernatants treated with different concentration ±s)Note: Compared with blank control group，*.P<0.05;△.P<0.01.

GroupsODvalueDCs∶T=1∶40DCs∶T=1∶20DCs∶T=1∶10DCs∶T=1∶5DCstreatedwith50μg/mlpolysaccharides0429±00141)0476±00142)0510±00022)0522±00022)DCstreatedwith100μg/mlpolysaccharides0438±00041)0524±00082)0547±00052)0563±00042)DCstreatedwith200μg/mlpolysaccharides0465±00082)0544±00102)0606±00062)0625±00052)DCstreatedwith300μg/mlpolysaccharides0470±00022)0592±00052)0623±00022)0656±00042)DCstreatedwith400μg/mlpolysaccharides0507±00052)0632±00162)0658±00032)0725±00102)Blankcontrol0407±00070440±00210467±00050464±0005

Note：Compared with blank control group,1)P<0.05;2)P<0.01.

2.3 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs吞噬能力的影響 未成熟DC經過不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖處理48 h后，吞噬FITC-dextran的能力逐漸降低，呈劑量依賴性，部分流式結果見圖3，50、100和200 μg/ml多糖濃度時陽性吞噬細胞百分率分別為(30.5±1.9)%、(28.6±1.4)%和(25.0±1.5)%，與空白對照組(35.8±1.1)%相比，差異無統計學意義(P>0.05)；當糖濃度達300 μg/ml及400 μg/ml時陽性吞噬細胞百分率分別為(20.0±2.0)%、(18.1±1.7)%，與空白對照組相比明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，說明300 μg/ml和400 μg/ml的多糖對DCs成熟的刺激作用較強，結果見圖4。

2.4 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs分泌細胞因子的影響 將不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖作用于DCs 72 h后，收集上清液，ELISA法檢測IL-12分泌水平，結果如圖5，不同濃度該多糖對DCs分泌IL-12的刺激能力不同，刺激作用呈劑量依賴性，50 μg/ml濃度多糖作用下DCs分泌IL-12的量最少，為(44.2±3.6)pg/ml，與空白對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，多糖為100 μg/ml時IL-12的分泌量為(49.3±2.1)pg/ml，與空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，隨多糖濃度增加DCs分泌IL-12的量亦逐漸升高，與空白對照組相比，差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖5。

2.5 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs刺激T細胞增殖能力的影響 將不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖處理的DCs作為刺激細胞刺激T細胞，發現不同比例的刺激細胞與T細胞混合孵育后均可見T細胞增殖，與空白對照組相比，經50 μg/ml和100 μg/ml多糖處理的DCs與T細胞比例為1∶40時，差異有統計學意義(P<0.05)，其余組與空白對照組相比，差異有顯著性(P<0.01)，說明多糖處理過的DCs具有一定的刺激T細胞增殖能力，見表1。

3 討論

多糖類化合物具有良好的生物活性，早在1943年便開始作為藥物使用。紅樹林真菌是生活在紅樹林生態系統中的第二大微生物資源[8]，長期生活在寡營養、弱堿性的含鹽海洋環境中，形成了獨特的耐饑、耐堿和耐鹽等生存機制，可產生出完全不同于陸生真菌的多糖類生物活性物質[9,10]。研究表明，紅樹林真菌胞外多糖主要為雜多糖，具有良好的抗病毒、抗腫瘤及免疫調節等生物活性[11,12]。

本研究用不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖處理小鼠骨髓源性未成熟DCs，觀察其對DCs功能成熟的影響，發現在所用多糖濃度范圍內均可刺激未成熟DCs 向成熟狀態分化，可促進DCs 表面CD11c 、MHCⅡ、CD80和CD86分子表達，尤其終濃度為400 μg/ml 的多糖刺激作用較強，CD11c、MHCⅡ雙陽性細胞和CD80、CD86雙陽性細胞百分率與空白對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05)，與LPS組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，CD11c 為DCs特征性標志，MHCⅡ參與對T細胞抗原肽的提呈并誘導免疫應答的發生，CD80、CD86為協同刺激分子，可為T 細胞的活化提供第二信號，DCs成熟時顯著上調MHCⅡ、CD80、CD86分子的表達，說明400 μg/ml多糖對DCs分化成熟的刺激作用較強，與LPS作用相似。經該多糖刺激的DCs吞噬FITC-dextran的能力亦逐漸降低，尤其經300、400 μg/ml多糖處理的DCs吞噬率與空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，說明300、400 μg/ml的多糖可顯著促進DCs成熟。該多糖還對DCs分泌IL-12具有一定刺激作用，100～400 μg/ml的多糖刺激作用較強，與空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，IL-12為促使Th0向Th1分化的關鍵細胞因子，在誘發細胞免疫應答中起著重要作用。另外，該多糖處理的DCs還具有刺激T細胞增殖的作用，將不同濃度多糖處理的DCs刺激T細胞，發現不同比例的DCs與T細胞混合孵育后均見T細胞增殖，增殖率與空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，說明多糖處理過的DCs具有一定的刺激T細胞增殖的能力。

總之，紅樹林來源的淡紫擬青霉胞外多糖可在一定程度上刺激小鼠骨髓源性DCs分化成熟，具有表現在可刺激DCs 表面CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86等分子的表達，下調其吞噬作用，促進IL-12分泌，刺激T細胞增殖，但具體機制需進一步研究。

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[收稿2016-08-12]

(編輯 張曉舟)

Effects of extracellular polysaccharides from Paecilomyces Lilacinuson on function of mouse bone marrow-derived dendritic cells

HUHai-Yan，WANGHua-Min,LINYing-Zi，CHANGCai-Hong,YANGWen,WANGYong-Xia.

ClinicalMedicalCollege，HainanMedicalUniversity，Haikou571109，China

Objective:To investigate the effects of the Paecilomyces Lilacinuson extracellular polysaccharides on the phenotypic and maturation of murine dendritic cells.Methods: Imature DCs were induced in vitro from the murine bone marrow cells in the presence of rmGM-CSF and rmIL-4,and then they were cultured with different dosage of the extracellular polysaccharides.The morphological characterization was analyzed under microscopy.The expressions of the DCs surface costimulating factors and phagocytic function to FITC-dextran were detected by flow cytometry.The level of IL-12 secreted by DCs was observed by ELISA.At the same time the influence of DCs on the proliferation of T cells was determined by MTT.Results: Treating with the polysaccharides for 48 h could up-regulate the expression of DCs surface molecules,such as CD11c,MHCⅡ,CD80 and CD86,and the 400 μg/ml was the optimal dose，comparing with the blank control group, the difference was significant (P<0.01), contrast to LPS control group that was not different (P<0.05).The uptaking FITC-dextran ability of the DCs treated with 300 μg/ml and 400 μg/ml polysaccharides was significant lower than the unstimulated DCs(P<0.05).At the same time the extract at different concentration could distinctly enhance the proliferation of T cells by DCs too.Conclusion: The extracellular polysaccharides could stimulate the maturation of dendritic cells and induce the production of mature dendritic cells.

Extracellular polysaccharides;Paecilomyces Lilacinuson;Dendritic cells;Phenotype;Maturation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.010

①本文為國家自然科學基金項目(31260225)、海南省自然科學基金項目(813248)和科研培育基金項目(HY2014-05)。

胡海巖(1979年-)，男，講師，主要從事感染免疫及免疫調節研究，E-mail:34171599@qq.com。通訊作者及指導教師：王永霞(1971年-)，女，碩士，副教授，主要從事感染與免疫研究，E-mail: 492608405@qq.com。

R392.9

A

1000-484X(2017)02-0212-05

②海南醫學院熱帶醫學與檢驗學院，海口571109。