一種家蠶后部絲腺高純度線粒體提取方法

陳金娥，李風波，何麗華，沈衛鋒

(浙江省農業科學院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021)

一種家蠶后部絲腺高純度線粒體提取方法

陳金娥，李風波，何麗華，沈衛鋒

(浙江省農業科學院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021)

為了從家蠶后部絲腺中提取高純度的線粒體，采用差速離心和非連續Percoll密度梯度離心方法，分離和純化家蠶后部絲腺線粒體，并通過電鏡觀察和蛋白免疫印跡驗證提取效果。結果表明，采用該方法分離的線粒體雜質少、純度高，并且線粒體內外膜結構完整。該研究建立了一種提取家蠶后部絲腺線粒體的方法，為進一步研究線粒體在家蠶后部絲腺中的功能奠定了基礎。

家蠶； 后部絲腺； 線粒體； 純化

線粒體是一種重要的細胞器，是細胞的產能、代謝和凋亡中心，在生命過程中發揮著重要的生理功能。線粒體除了生產ATP為細胞供能外，還具有組織特異性以適應不同組織的生理需要，在真核生物的生長發育過程及先天免疫中起重要作用[1-5]。對線粒體結構與功能的研究通常是在離體的線粒體上進行的，因此從某一組織獲得高純度的線粒體是研究線粒體組織功能的關鍵。家蠶幼蟲絲腺是合成分泌絲蛋白的重要組織器官，其中，后部絲腺是專門分泌絲素蛋白的部分，絲素在蠶絲蛋白中大約占70%～80%，研究后部絲腺的功能對提高蠶絲的品質和產量具有重要意義。以往對昆蟲線粒體方面的研究大多只采用差速離心獲得的線粒體[3,6-7]，但是差速離心只能用于分離不同大小、體積和質量的細胞器，對于一些相近的細胞器和物質則難以去除，如果要深入研究線粒體的功能，則需要獲得高純度線粒體，為此需要進一步的純化。本文介紹了一種聯合差速離心和密度梯度離心，從家蠶后部絲腺獲得高純度線粒體的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶p50品種，在標準條件(25 ℃，濕度85%)下催青，用桑葉喂養至5齡第3天。在立體顯微鏡下解剖家蠶幼蟲，取后部絲腺組織，3個重復，每個重復1.2 g組織(10～12條蠶)，用0.9% NaCl清洗3遍。

蔗糖(Sucrose)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉丙烯酰胺(N, N′-Methylene bisacrylamide)均購自Amresco公司；Percoll和Protein marker購自GE公司；細胞色素(Cytochrome)c抗體定制于杭州華安生物技術有限公司；Western及IP細胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑均購自碧云天生物公司；蛋白定量試劑盒及其他試劑均購于上海生工生物公司。

1.2 線粒體的分離和純化

線粒體分離和純化參考Alonso等[8]和Sims等[9]的方法有所修改。

在后部絲腺中以1∶10加入STE勻漿緩沖液(100 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1EDTA, 2.5 mol·L-1sucrose，pH值7.4)，冰上放置10 min，用杜恩斯勻漿器的松勻漿棒上下勻漿8次，再用緊勻漿棒上下勻漿10～12次。

把勻漿液移入10 mL離心管中，于4 ℃、1 000g離心10 min，取上清，于4 ℃、10 000g離心10 min，棄上清，沉淀即為粗提的線粒體樣品。

沉淀中加入2 mL 15% Percoll溶液，輕輕吹打，充分混勻。然后沿壁緩慢加到由3 mL 23% Percoll溶液和3 mL 40%的Percoll溶液組成的非連續Percoll密度梯度中，4 ℃、31 000g離心5 min。

沉淀在Percoll密度梯度中分為3層，線粒體位于23%/40%之間的那一層，小心取出線粒體層并加入10 mL STE溶液進行稀釋。于4 ℃、16 500g離心30 min。棄上清，取沉淀，再加入10 mL STE溶液稀釋，于4 ℃、15 000g離心10 min，沉淀即為純化的線粒體樣品。

1.3 電鏡觀察

在粗提和純化線粒體沉淀中逐滴加入戊二醛固定液浸泡整個沉淀，4 ℃固定過夜；用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH值7.4)漂洗3次，每次15 min；用1%鋨酸溶液固定2 h，然后用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min；用梯度溶液(50%、70%、80%和90%丙酮)脫水，每種濃度各處理15 min，再用100%丙酮處理2次，每次15 min；用體積比為2∶1的丙酮與包埋劑浸漬液浸漬4 h，之后用體積比1∶2的丙酮∶包埋劑浸漬液浸漬12 h，再用純包埋液浸漬2次，每次12 h；將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中，將包埋板置于65 ℃各聚合48 h以上；對樣品進行超薄切片，切片厚度70 nm，經乙酸雙氧鈾染色10 min后清洗，最后置于透射電子顯微鏡FEItecnai G2 spirit下觀察并拍照。

1.4 免疫蛋白印跡

配制15% SDS-PAGE膠，粗提線粒體樣品和純化線粒體樣品用Western及IP細胞裂解液裂解，蛋白上樣量均為20 μg，于150 V電泳80 min；100 V轉膜35 min；5%脫脂牛奶常溫下封閉1 h后，在常溫下孵育一抗(Cytochrome c 抗體1∶2 000稀釋)1 h；TBST洗3次，每次10 min；用5%脫脂奶粉1∶5 000稀釋羊抗鼠HRP，反應體積1 mL，室溫搖床上反應1 h；TBST洗3次，每次10 min；ECL顯影，底物反應3 min曝光(Bio-Rad凝膠成像分析儀)。

2 結果與分析

2.1 非線性蔗糖密度梯度離心結果及線粒體得率

組織勻漿液經差速離心后獲得后部絲腺粗提線粒體樣品，粗提線粒體樣品經Percoll密度梯度離心后，離心管內液體明顯分為3層(圖1)。大部分線粒體集中于Percoll非線性密度梯度23%/40%的位置；通過蛋白濃度測定計算，3次重復的線粒體得率分別為78(0.006 5%)、388(0.032%)、280(0.023%)μg。

圖1 非連續性Percoll密度梯度離心純化線粒體

2.2 透射電子顯微鏡觀察線粒體的純度和完整性

通過透射電鏡觀察粗提線粒體樣品和純化線粒體樣品，發現經密度梯度離心后線粒體明顯被富集，雜質明顯減少，并且破損的線粒體也減少；純化后的線粒體結構完整，包含完整的內外膜結構(圖2)，說明純化效果較好。

圖2 透射電鏡觀察粗提線粒體(A)和純化線粒體(B)

2.3 蛋白免疫印跡檢測線粒體純度

為了進一步檢驗純化效果，用蛋白免疫印跡方法進行了驗證。結果(圖3)發現，經過密度梯度離心后，線粒體明顯被進一步富集。用于檢測的抗體細胞色素c(cytochrome c)位于線粒體內膜和外膜的間隙，進一步證明分離到的線粒體內外膜結構的完整性。

圖3 免疫印跡檢測線粒體純度

3 討論

提取純凈并且結構完好的線粒體是離體線粒體研究工作的必要前提。本文介紹了一種提取家蠶后部絲腺高純度線粒體的方法，該方法不需要太高的離心速度即可實現純化。通過電鏡觀察以及蛋白免疫印跡驗證了分離到的線粒體內外膜結構完整，雜質少，并且線粒體得率為0.01%～0.03%，能滿足線粒體相關研究所需的量，證實了該方法的實用性，為家蠶后部絲腺線粒體離體功能測定、線粒體基因組、轉錄組和蛋白質組的研究奠定了基礎。

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(責任編輯：侯春曉)

2016-11-11

浙江省自然科學基金項目(LY14C170001)；浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地項目(2010DS700124-KF1514)

陳金娥(1979—)，女，浙江上虞人，助理研究員，博士，從事家蠶蛋白質組學的研究工作，E-mail：chenje79@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170249

S881.2

A

0528-9017(2017)02-0347-02

文獻著錄格式：陳金娥，李風波，何麗華，等. 一種家蠶后部絲腺高純度線粒體提取方法[J].浙江農業科學，2017，58(2)：347-348，352.