黃精多糖通過TLR4-MyD88-NF-κB通路抑制缺氧/復氧H9c2心肌細胞炎性因子釋放

雷升萍，王 靚,2，龍子江,2，施 慧，高華武，2，朱永恒，李 麗

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230038；2.安徽省醫學科學研究院，安徽 合肥 230022)

黃精多糖通過TLR4-MyD88-NF-κB通路抑制缺氧/復氧H9c2心肌細胞炎性因子釋放

雷升萍1，王 靚1,2，龍子江1,2，施 慧1，高華武1，2，朱永恒1，李 麗1

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230038；2.安徽省醫學科學研究院，安徽 合肥 230022)

目的 探討黃精多糖(Polygonatumsibiricumpolysaccharides，PSP)對缺氧/復氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)誘導H9c2心肌細胞Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)-髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)-核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號通路的調節作用。方法 體外培養H9c2心肌細胞并隨機分組：正常對照組(C組)、模型組(H/R組)、黃精多糖組(PSP組)、TLR4抑制劑(TAK-242組)和PSP+TAK-242組。C組細胞用正常培養液常規培養27 h；H/R組細胞進行缺氧21 h/復氧6 h處理；TAK-242組、PSP組和PSP+TAK-242組的細胞在缺氧培養21 h前分別加入含TAK-242、PSP和PSP+TAK-242的培養基培養12 h，在常規條件下復氧6 h。PSP和TAK-242的終濃度分別是1.5 g·L-1和1 μmol·L-1。處理結束后，采用MTT法檢測細胞活力，ELISA法檢測細胞上清液中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和白介素(interleukin,IL)-1β含量，Western blot檢測NF-κB和inhibitor κBα(IκBα)的蛋白表達，熒光定量PCR法檢測H9c2心肌細胞中TLR4、MyD88的mRNA表達。結果 與H/R組比較，PSP組、TAK-242組和PSP+TAK-242組均能明顯提高H/R損傷后心肌細胞的存活率，減輕其炎性因子滲出，明顯下調NF-κB的表達，抑制H/R誘導的IκBα蛋白的降解，降低TLR4和MyD88基因的表達。結論 PSP保護H9c2心肌細胞H/R損傷的機制可能與抑制TLR4-MyD88-NF-κB信號通路有關。

黃精多糖；H9c2心肌細胞；缺氧/復氧；TLR4；MyD88；NF-κB；炎癥

心肌缺血/再灌注損傷是目前臨床面臨的主要挑戰及難題。氧化應激和炎癥是心肌缺血/再灌注損傷的主要機制，研究發現Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是參與心肌缺血/再灌注損傷的主要炎癥反應[1]。TLR4在不同細胞中均可表達，被激活后導致促炎性細胞因子的產生及其表達上調[2]。據報道，TLR4與病原相關分子結合后，啟動髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)進行細胞內信號轉導，激活核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)。NF-κB和IκBα是一個相互調節的系統，IκBα的迅速積累可抑制NF-κB活性，TNF-α誘導含IκBα的細胞后，可見NF-κB高度表達，進而刺激一系列的炎癥介質如TNF-α和IL-1β等的釋放，破壞機體心臟免疫系統，最終引起炎癥因子大量釋放，刺激炎癥反應發生，致使心肌細胞發生凋亡等[3-5]。

黃精多糖(Polygonatumsibiricumpolysaccharides，PSP)是百合科黃精屬黃精的干燥根莖通過水提醇沉、超聲波提取或微波輔助提取等提取方法而得，主要由4種化學結構不同的單糖組成，其中以β-(1,2)鍵相連的果糖為主鏈，以α構型的葡萄糖為側鏈連接于主鏈上。PSP的相對分子質量為8 921 u，其中果糖 ∶葡萄糖=8.7 ∶1[6]。PSP具有抗炎、抗腫瘤、抗凋亡和降低脂肪等多種生物活性[7-8]。研究報道，PSP對缺血/再灌注模型大鼠的心肌損傷具有改善作用，能夠減輕炎癥反應，其修復缺血心肌損傷的機制可能與調節NF-κB信號通路有關[9]。TLR4是NF-κB上游調控基因，期間有依賴性分子MyD88銜接，但有關PSP對TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的調節作用未見報道。因此，本研究采用TLR4抑制劑TAK-242[10]，以缺氧/復氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)誘導H9c2心肌細胞損傷為模型，旨在探討：① PSP對H/R損傷心肌細胞的影響；② PSP能否降低H/R誘導H9c2細胞的TLR4/MyD88/NF-κB的炎性表達；③ PSP與H/R介導的TLR4/MyD88/NF-κB的關系如何；④ PSP能否通過調控TLR4/MyD88/NF-κB對抗H/R引起的心肌損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 H9c2大鼠胚胎心肌細胞株購于中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心。

1.1.2 藥物與試劑 黃精多糖(由安徽省醫學研究院提取并檢測，含多糖為97%，應用前采用培養液稀釋成濃度為1.5 g·L-1使用)；TLR4抑制劑TAK-242(購于InvivoGen公司)；DMEM、胎牛血清、TRIzol、DMSO和Tween-20均購于美國Life Technologies公司；四甲基偶氮唑藍(MTT,Sigma公司)；TNF-α、IL-1β酶聯免疫吸附試劑盒購自武漢博士德生物有限公司；NF-κB、IκBα和β-actin抗體購于Abcam公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒(上海碧云天公司)；PVDF膜(美國密理博公司)；引物由Invitrogen公司鑒定并合成；逆轉錄試劑盒(Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)(Thermo公司)。

1.1.3 儀器 3111型-恒溫CO2培養箱(美國Thermo公司)；ATOM全自動酶聯免疫工作站(意大利MAROCHE)；3K15-高速冷凍離心機(德國Sigma公司)； SW-CJ系列潔凈工作臺(AIRTECH，蘇州安泰空氣技術有限公司)；缺氧小室(加拿大Stem Cell公司)；CXY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；熒光定量PCR儀(Thermo PIKOREAL96)。

1.2 方法

1.2.1 H9c2心肌細胞培養 將H9c2心肌細胞株放于37℃、95%空氣-5% CO2培養箱中，用含15%胎牛血清的DMEM完全培養基培養。待細胞融合度為85%左右時，用質量濃度為0.25 g·L-1的胰酶消化，計數，以1.0×106個細胞接種于25 cm2的培養瓶進行傳代，每2 d換液1次，每3～4 d傳代1次。取對數生長期的心肌細胞用于后續實驗。

1.2.2 H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷模型建立 待細胞融合至95%后，棄掉細胞培養基，加入預先經37℃、95% N2-5% CO2的混合氣體飽和30 min的無血清DMEM模擬缺氧液，放入缺氧小室中，通入95% N2-5% CO2的混合氣體5 min驅除氧氣，置于37℃培養箱中培養21 h進行缺氧，然后將缺氧液換為含正常培養基，于37℃、95%空氣-5% CO2培養箱中培養6 h模擬復氧[11-12]。

1.2.3 實驗分組及處理 將培養的H9c2心肌細胞隨機分為5組：正常對照組(C組)、H/R組、TAK-242組、PSP組和PSP+TAK-242組。C組細胞用正常培養液(質量濃度為15 g·L-1胎牛血清的DMEM完全培養基)在37℃、95%空氣-5% CO2培養箱中培養27 h；H/R組細胞處理同“1.2.2”步驟；TAK-242組、PSP組和PSP+TAK-242組的細胞在缺氧培養21 h前，缺氧處理方法同步驟“1.2.2”，先分別加入含TAK-242、PSP和PSP+TAK-242的培養基培養12 h，在37℃、95%空氣-5% CO2培養箱中復氧培養6 h。

1.2.4 MTT法檢測細胞存活率 將經15%胎牛血清DMEM培養的細胞懸液制成5.0×107·L-1細胞懸液，以每孔0.1 mL接種于96孔板，邊緣孔用不含細胞的正常培養液填充，將細胞培養板置于37℃、95%空氣-5% CO2培養箱培養。待細胞融合至95%后，按照“1.2.3”步驟進行分組及處理，結束后每孔加入0.02 mL MTT溶液(0.5 mg·L-1)，于37℃、95%空氣-5% CO2培養箱孵育4 h，吸去細胞上清液，每孔加入0.15 mL二甲基亞砜，于低速搖床振蕩10 min，置于酶標儀上490 nm測定各組吸光度值。空白對照組只加培養液不加細胞，并將其設為調零孔。細胞存活率/%=(OD實驗組-OD空白對照組)/(OD正常對照組-OD空白對照組)×100%，并計算平均值。每組6個復孔，實驗獨立重復3次。

1.2.5 ELISA法檢測細胞培養液TNF-α和IL-1β含量 將經15%胎牛血清的DMEM培養的細胞懸液制成1.0×108·L-1細胞懸液，以每孔1 mL接種于無菌6孔板，將6孔板置于37℃、95%空氣-5% CO2培養箱培養，待細胞融合至95%后，按照“1.2.3”步驟進行分組及處理細胞。結束后，收集孔板內的細胞培養液，3 000×g，離心10 min。取上清20 μL。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。實驗獨立重復3次。

1.2.6 Western blot法檢測NF-κB、IκBα蛋白表達 將含細胞的培養液制成1.0×108·L-1細胞懸液，以每孔1 mL接種于無菌6孔板，將6孔板置于37℃、95%空氣-5% CO2培養箱培養，待細胞融合至95%后，按照“1.2.3”步驟進行分組及處理細胞。結束后，每孔加入1 mL含PMSF質量濃度為10 g·L-1的蛋白裂解液，于冰上裂解30 min后，將其置于4℃、20 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度并調整。應用SDS-PAGE凝膠試劑盒配制分離膠，每個泳道蛋白上樣量為20 μg，跑膠時電壓為80 V，待條帶進入分離膠，電壓增至120 V。于120 V、2 000 mA恒流轉膜120 min后，用質量濃度為5 g·L-1脫脂奶粉將PVDF膜封閉2 h，之后置于搖床上，TBST漂洗3次，每10 min 1次，將含蛋白的PVDF膜孵一抗，4℃過夜。次日用TBST液于搖床上漂洗，每10 min 1次，3次后，將膜放入二抗中37℃孵育2 h，TBST漂洗3次后，采用ECL發光試劑盒，在Tanon全自動凝膠成像系統中自動曝光，采集圖像，并進行蛋白條帶灰度掃描。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶光密度值/β-actin條帶光密度值，再以C組為標準，進行統計學分析。

1.2.7 熒光定量PCR檢測心肌細胞TLR4、MyD88 mRNA表達水平 將含細胞的培養液制成1.0×108·L-1細胞懸液，以每孔1 mL接種于無菌6孔板，將6孔板置于37℃、95%空氣-5% CO2培養箱培養，待細胞融合至95%后，按照“1.2.3”步驟進行分組及處理細胞。結束后，棄掉細胞培養液，PBS小心清洗2次，TRIzol試劑完全裂解細胞，將細胞裂解液用氯仿抽提，異丙醇沉淀，回收總RNA于-80℃貯存備用。質量濃度為1 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(A260/A280)鑒定RNA濃度及純度。取1 μL進行反轉錄，在熒光定量PCR儀上進行PCR擴增和檢測，反轉錄反應條件為：42℃、60 min，99℃、2 min，4℃保存。TLR4、MyD88、β-actin的引物序列見Tab 1。PCR反應條件是：94℃ 45 s，55℃ 50 s，72℃ 75 s。循環擴增40次結束后，獲得TLR4 mRNA、MyD88 mRNA的循環閾值(cycle threshold，Ct)，應用△△Ct(△△Ct=△Ct目的基因-△Ct內參基因)方法分析，計算出2-△△Ct目的基因的相對表達量后，進行統計分析。

Tab 1 Primers of detected genes

2 結果

2.1 PSP對H9c2心肌細胞H/R損傷后存活率的影響 如Fig 1所示，H9c2心肌細胞經過缺氧21 h復氧6 h處理后，細胞存活率(45.08±0.08)%明顯降低，與C組(98.12±0.03)%比較差異有明顯統計學意義(P<0.01)；PSP組(78.12±0.03)%、TAK-242組(76.26±0.08)%和PSP+TAK-242組(74.22±0.04)%的心肌細胞存活率明顯升高，與H/R組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

Fig 1 Effect of PSP on survival rates of H9c2 cells exposed to simulated H/R

##P<0.01vscontrol；**P<0.01vsH/R

2.2 PSP對H/R誘導的H9c2心肌細胞TNF-α和IL-1β的影響 如Fig 2所示，與正常對照組相比，H/R組細胞培養液中炎性因子TNF-α和IL-1β的含量均明顯增多(P<0.01)；而PSP處理組的心肌細胞培養液中炎性因子TNF-α和IL-1β含量均明顯少于H/R組(P<0.01)，其中PSP+TAK-242組中炎性因子TNF-α和IL-1β的含量明顯下調(P<0.01)。

Fig 2 Effect of PSP on TNF-α and IL-1β expression of myocardial cells by H/R

#P<0.05,##P<0.01vsH/R；**P<0.01vscontrol

2.3 PSP對H9c2心肌細胞NF-κB、IκBα蛋白表達水平的影響 NF-κB是介導炎癥反應的關鍵調控蛋白。Fig 3 Western blot結果顯示，PSP能明顯抑制H/R刺激的H9c2心肌細胞NF-κB(0.88±0.13)至(0.52±0.19)(P<0.01)，抑制H/R誘導的IκBα蛋白的降解(0.59±0.04)至(1.30±0.22)(P<0.01)；其中TAK-242組中NF-κB和IκBα蛋白表達水平與PSP組比較無統計學意義(P>0.05)。

Fig 3 Effects of PSP on NF-κB and IκBα protein expression of H9c2 cells by H/R

A：Western blot analysis of NF-κB，IκBα and β-actin protein；B：The relative protein expression of NF-κB and IκBα bands was normalized to β-actin.##P<0.01vscontrol；*P<0.05，**P<0.01vsH/R

2.4 PSP對H9c2細胞TLR4、MyD88的mRNA表達的影響 結果如Fig 4所示，正常對照組中H9c2心肌細胞的TLR4和MyD88的mRNA表達水平很低(0.95±0.33)和(1.06±0.18)，H/R損傷后表達均明顯上調(5.83±2.04)和(2.56±0.24)(P<0.01)，PSP組和TAK-242組均能抑制上述基因的表達。

3 討論

TLR4是Toll家族的一類分子，它的結構及其在促炎、促免疫細胞成熟分化及調節免疫應答等方面研究較清楚。機體受到外界刺激時，首先啟動先天性免疫反應，激活TLR4表達，促使獲得性免疫應答開啟，通過其依賴性接頭蛋白MyD88信號轉導途徑，誘導NF-κB活化。一些內源性配體通過激活TLR4受體及激活NF-κB，致使炎性因子如TNF-α、IL-1β和IL-6等釋放[13]。MyD88是TLR4信號途徑中起重要作用的分子。MyD88有依賴性和非依賴性2種途徑，其依賴性途徑主要是通過介導NF-κB信號通路的活化及與相關細胞因子所產生。NF-κB是炎性反應基因的重要轉錄激活因子，它的激活能調控許多炎性因子的表達，是炎癥反應發生、發展的關鍵環節[14]。

Fig 4 Effects of PSP on mRNA levels of TLR4 and MyD88 in H/R-stimulated H9c2 cells

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsH/R

心肌缺血/再灌注患者的心肌組織嚴重受損，受損的心肌組織暴露于缺氧的環境中，促使大量TLR4等巨噬細胞的募集，明顯增加了心肌細胞對缺血/缺氧環境的敏感性，因此激活了TLR4/MyD88/NF-κB信號通路[15]。研究發現，TLR4抑制劑TAK-242對H/R細胞處理后，心肌細胞的炎性滲出因子、核因子和TLR4、MyD88的mRNA表達較H/R組明顯下降，提示TLR4抑制劑TAK-242可有效阻斷TLR4的啟動，中斷炎性因子的釋放及其對機體的損傷。PSP處理后TLR4、MyD88、NF-κB水平明顯下調，心肌細胞液中炎性因子TNF-α和IL-1β含量明顯降低，而同時加入PSP和TLR4抑制劑后，NF-κB蛋白表達明顯下調，有效抑制H/R刺激IκBα的降解，推測PSP保護心肌細胞的作用機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路有關。

綜上所述，本實驗以體外培養H/R誘導H9c2心肌細胞為研究對象，發現PSP對H/R損傷H9c2心肌細胞具有保護作用，其保護作用機制通過阻斷TLR4-MyD88-NF-κB信號通路，下調H/R介導心肌細胞炎性因子表達，從而減輕細胞炎癥反應。

(致謝：本文所有實驗均在安徽中醫藥大學中西藥研究與開發重點實驗室、安徽中醫藥大學科學實驗中心完成。)

[1] Gao Y，Fang X B，Tong Y，et al.TLR4-mediated MyD88-dependent signaling pathway is activated by cerebral ischemia-reperfusion in cortex in mice[J].BiomedPharmacother，2009，63:442-50.

[2] Liu L，Gu H，Liu H，et al.Protective effect of resveratrol against IL-1β-induced inflammatory response on human osteoarthritic chondrocytes partly via the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway：an“invitrostudy”[J].IntJMolSci,2014，15(4):6925-40.

[3] 鄧 超，任改艷，孫阿寧，等.豆蔻明對TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS信號通路的調節作用[J].中國藥理學通報，2016，32(6):779-83.

[3] Deng C，Ren G Y，Sun A N，et al.The regulatory effect of cardamonin on TLR4/MyD88/NF-κB/iNOS pathway[J].ChinPharmacolBull，2016，32(6):779-83.

[4] Chen Z J，Parent L，Maniatis T，et al.Site-specific phosphorylation of IκBα by a novel ubiquitination-dependent protein kinase activity[J].Cell，1996，84(6)：853-62.

[5] Wu B Y，Woffendin C，Duckett C S，et al.Regulation of human retroviral latency by the NF-κB/IκB family：inhibition of human immunodeficiency virus replication by IκB through a Rev-dependent mechanism[J].ProcNatlAcadSciUSA，1995,92(5)：1480-4.

[6] 李 麗，田麗娜，任振興，等.黃精多糖的結構分析及功能活性研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志，2015，21(15):231-5.

[6] Li L，Tian L N，Ren Z X，et al.Structural analysis and functional activity research progress ofPolygonatumsibiricumpolysaccharides[J].ChinJExpTraditMedForm，2015，21(15): 231-5.

[7] 段 華，王保奇，張躍文.黃精多糖對肝癌H22移植瘤小鼠的抑瘤作用及機制研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2014，25(1):5-8.

[7] Duan H，Wang B Q，Zhang Y W.Anti-tumor effects and mechanism of rhizoma polygonati polysaccharide on H22 tumor bearing mice[J].TraditChinDrugResClinPharmacol，2014，25(1):5-8.

[8] 胡國柱，聶榮慶，肖移生，等.黃精多糖對新生大鼠大腦皮層神經細胞缺氧性凋亡的影響[J].中藥藥理與臨床，2005，21(4):37-40.

[8] Hu G Z，Nie R Q，Xiao Y S，et al.Influence of polygonatum polysaccharide on apoptosis of primary cultured neonate rat cerebral cortical neurons caused by hypoxia[J].PharmacolClinChinMaterMed，2005，21(4):37-40.

[9] 李 麗，龍子江，黃 靜，等.黃精多糖對急性心肌梗死模型大鼠NF-κB介導的炎癥反應及心肌組織形態的影響[J].中草藥，2015，46(18)：2750-5.

[9] Li L，Long Z J，Huang J，et al.Effect ofPolygonatumsibiricumpolysaccharides on inflammatory reaction mediated by NF-κB and myocardium tissue morphology in acute myocardial infarction rats[J].ChinTraditHerbDrugs，2015，46(18)：2750-5.

[10]Hua F，Tang H L，Wang J，et al.TAK-242，an antagonist for Toll-like receptor 4，protects against acute cerebral ischemia/reperfusion injury in mice[J].JCerebBloodFlowMetab，2015，35(4):536-42.

[11]Park M，Youn B，Zheng X L，et al.Globular adiponectin，acting via AdipoR1/APPL1，protects H9c2 cells from hypoxia/reoxygen-action-induced apoptosis[J].PLoSOne，2011，6(4)：e19143.

[12]韓正怡，何淑芳，程 潔，等.嗎啡預處理對H9c2心肌細胞缺氧/復氧時microRNA表達的影響[J].中國藥理學通報，2015，31(11):1552-7.

[12]Han Z Y，He S F，Cheng J，et al.Effects of morphine preconditioning on expression of microRNAs during hypoxia-reoxygenation in H9c2 myocardial cells[J].ChinPharmacolBull，2015，31(11):1552-7.

[13]Lin X F，Kong J J，Wu Q T，et al.Effect of TLR4/MyD88 signaling pathway on expression of IL-1β and TNF-α in synovia fibroblasts from temporomandibular joint exposed to lipopolysaccharide[J].MediatorsInflamm，2015,2015:329405.

[14]雷梅先，王云開，殷 然，等.肝X受體通過NF-κB信號通路減輕高糖誘導的H9c2細胞凋亡[J].中國藥理學通報，2014,30(12):1698-704.

[14]Lei M X,Wang Y K,Yin R,et al.Liver X receptors attenuate high glucose-induced apoptosis in H9c2 cells through NF-κB signaling pathway[J].ChinPharmacolBull，2014,30(12):1698-704.

[15]李燕巍, 謝廣茹, 李 玲, 等. TLR4/MyD88/NF-κB信號通路對LPS誘導的人鼻咽癌5-8F細胞增殖及凋亡的影響[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2015, 29(11): 1012-5.

[15]Li Y W，Xie G R，Li L，et al.The effect of TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway on proliferation and apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells induced by LPS[J].JClinOtorhinolaryngolHeadNeckSurg,2015，29(11):1012-5.

Inhibitory effect ofPolygonatumsibiricumpolysaccharides

on release of inflammatory cytokines of anoxia/reoxygenation H9c2 myocardial cells through TLR4-MyD88-NF-κB signaling pathway

LEI Sheng-ping1，WANG Liang1,2，LONG Zi-jiang1,2，SHI Hui1， GAO Hua-wu1，ZHU Yong-heng1，LI Li1

(1.CollegeofPharmacy，AnhuiUniversityofChineseMedicine，Hefei230038，China； 2.AnhuiAcademyofMedicalSciences，Hefei230022，China)

Aim To assess the regulatory effects ofPolygonatumsibiricumpolysaccharides(PSP) on Toll-like receptor 4(TLR4)-myeloid differentiation factor 88(MyD88)-nuclear factor κB(NF-κB) signaling pathway in anoxia/reoxygenation-H9c2 myocardial cells.Methods The H9c2 myocardial cells culturedinvitrowere randomly divided into groups：control group(C group)，hypoxia/reoxygenation group(H/R group)，PSP group，TLR4 inhibitor group(TAK-242 group)and PSP+TLR4 inhibitor group(PSP+TAK-242 group).The cells were cultured in normal condition for 27 h in C group.The cells were subjected to 21 h hypoxia followed by 6 h reoxygenation in H/R.Definitely，the cells in TAK-242，PSP and PSP+TAK-242 groups were treated with PSP and TAK-242 with the final concentration of 1.5 g·L-1and 1 μmol·L-1for 12 h before 21 h hypoxia, then the cells were exposed to the normal culture condition for another 6 h. After the treatment，cell survival rate was tested by MTT method.The contents of tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-1β(IL-1β)were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The protein expression levels of NF-κB and inhibitor κBα(IκBα)were detected by Western blot，and the expression levels of TLR4 and MyD88 mRNA were detected by fluorescence quantitative PCR method.Results Compared with H/R group，the cell survival rates were significantly increased，while the inflammatory cytokines contents and NF-κB protein expression were dramatically decreased in groups PSP，TAK-242 and PSP+TAK-242，whereas the NF-κB expression was significantly down-regulated，and the IκBα protein expression was increased. The mRNA expression levels of TLR4 and MyD88 were markedly decreased.Conclusion PSP might protect H9c2 myocardial cells against H/R injury, which may be associated with the inhibition of TLR4-MyD88-NF-κB pathway.

Polygonatumsibiricumpolysaccharides；H9c2 myocardial cells；anoxia/reoxygenation；TLR4；MyD88；NF-κB；inflammation

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.042.html

2016-11-18,

2016-12-16

安徽省高校優秀青年人才支持計劃重點項目(No 1608085QH222)；國家自然科學基金青年項目(No 81202631)；安徽省科技廳自然科學基金項目(No 1508085QH192)

雷升萍(1988-)，女，碩士生，研究方向：心腦血管藥理學,E-mail: 1204026886@qq.com; 龍子江(1957-),男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：心腦血管藥理學，通訊作者，E-mail:lzjys@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.021

A

1001-1978(2017)02-0255-06

R284.1；R322.11；R364.5；R392.12；R845.22