參麥注射液主要成分與卒中關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)藥理作用機(jī)制和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

呂燕妮, 付龍生, 周 健，潘曉林，陳璿瑛，萬 青

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江西 南昌 330006)

參麥注射液主要成分與卒中關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)藥理作用機(jī)制和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

呂燕妮, 付龍生, 周 健，潘曉林，陳璿瑛，萬 青

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江西 南昌 330006)

Network pharmacological mechanism of main components of Shenmai injection related with stroke and experimental verification

LYU Yan-ni, FU Long-sheng, ZHOU Jian, PAN Xiao-lin, CHEN Xuan-ying, WAN Qing

(DeptofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué); 參麥注射液; 卒中; 作用機(jī)制; 信號通路; 腦缺血/再灌注損傷

network pharmacology; Shenmai injection; stroke: action mechanism; signaling pathway; cerebral ischemia/reperfusion injury

參麥注射液是傳統(tǒng)中藥紅參與麥冬的復(fù)方制劑，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津、生脈等功效。除對心臟和免疫功能疾病的防治外，對缺血性卒中也有明顯療效，其可協(xié)同降壓藥、溶栓藥等西藥，改善腦缺血預(yù)后。兩味主藥中，紅參可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基，麥冬亦可通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)免疫力和耐缺氧能力。然而，由于化學(xué)成分的復(fù)雜性和功能主治的多樣性，其與缺血性卒中關(guān)聯(lián)的作用機(jī)制仍不明確， 仍停留在整體動物指標(biāo)，缺乏深入的分子生物學(xué)水平，尤其缺乏分子信號通路水平研究，其更能有效地作為生物標(biāo)記物反映藥理效應(yīng)和作用機(jī)制的變化。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[1-2]與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等方法，挖掘參麥注射液中主要成分與缺血性卒中間的關(guān)聯(lián)，闡釋其與臨床療效相關(guān)的分子機(jī)制，有利于加強(qiáng)中藥基礎(chǔ)與臨床研究的溝通，更好地服務(wù)于臨床。

1 材料與方法

1.1 文本挖掘 在 TCMGeneDIT系統(tǒng)中，以兩味主藥紅參、麥冬中的20個成分為研究對象(其中魯司可皂苷元和薯蕷皂苷元以這2個皂苷元的英文名為搜索詞)，搜索條件的閾值為大于概率0.95，以自動文本挖掘方式搜索與化合物相互作用的蛋白信息。同樣在Agilent Literature Search中，以人參和麥冬英文名進(jìn)行搜索，對TCMGeneDIT數(shù)據(jù)庫中的蛋白信息進(jìn)行補(bǔ)充。

1.2 反向?qū)?在Pharmmapper數(shù)據(jù)庫中，以成分的mol2格式輸入search欄中，設(shè)置參數(shù)為不選擇構(gòu)象變化，其余設(shè)置參數(shù)為默認(rèn)選項(xiàng)，截?cái)嘀禐?.0，選擇人類數(shù)據(jù)庫，產(chǎn)生默認(rèn)的300個構(gòu)象后，按照打分最終選取50個蛋白構(gòu)象。將反向?qū)赢a(chǎn)生的構(gòu)象與“1.1”節(jié)中文本挖掘所產(chǎn)生的構(gòu)象，合并為參麥注射液作用蛋白集。

1.3 參麥注射液多成分-蛋白網(wǎng)絡(luò)與信號通路的映射 在Genecards數(shù)據(jù)庫中，以stroke進(jìn)行搜索，搜索出與stroke相關(guān)聯(lián)的2 494個蛋白，與“1.2”節(jié)中蛋白集進(jìn)行交集，最終得參麥注射液化合物相互作用蛋白群。以相互作用蛋白群中的蛋白名為檢索詞，從Genecards、BIND、BioGRID、IntAct、MINT等數(shù)據(jù)庫中，建立蛋白關(guān)聯(lián)詞條，Cytoscape中建立蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。ClusterONE插件提取具有顯著性差異(P<0.05)的子網(wǎng)絡(luò)，并將網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵蛋白進(jìn)行Biocart信號通路映射。

1.4 小鼠局灶性中動脈梗死(MCAO)模型制備及參麥注射液給藥 C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量18～22 g，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。參麥注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司)。術(shù)前1 h參麥注射液5 mL·kg-1腹腔注射。

1.5 Western blot法與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Western blot法檢測小鼠皮層邊緣組織p38、ERK1、ERK2、IKKα、IKKβ表達(dá)(抗體1 ∶1 000稀釋)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因變量多因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 參麥注射液主要成分-蛋白網(wǎng)絡(luò)的分析 參麥注射液的20個成分，共作用于61個蛋白，參麥注射液多成分蛋白網(wǎng)絡(luò)平均Degree為4.165，其中14個成分其連接度達(dá)到5以上，人參皂苷與全部蛋白網(wǎng)絡(luò)中的蛋白均有相互作用。2個麥冬皂苷元成分與CASP3、CHUK、HSAP90AA1、MAPK1、MAPK14、NFKB1 6個蛋白有相互作用，這6個蛋白在網(wǎng)絡(luò)中 占據(jù)高連接度，對網(wǎng)絡(luò)健康度有極大影響。

2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析 60個蛋白構(gòu)成無孤立結(jié)點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，提取差異有顯著性(P<0.01)的子網(wǎng)絡(luò)1個，子網(wǎng)絡(luò)中含有關(guān)鍵蛋白19 個(Tab 1)，在Biaocart信號通路上映射及富集分析(Tab 2)，涉及MAPK、NF-κB、AKT與Toll樣受體等信號通路。

2.3 關(guān)鍵蛋白和信號通路的驗(yàn)證 MAPK信號通路是富集指數(shù)P最小的信號通路，是參麥注射液作用于MCAO模型最有可能的潛在信號通路，與MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14蛋白所調(diào)控的MAPK受體及信號通路變化一致。參麥注射液干預(yù)后，對MCAO模型中上調(diào)的p38、ERK1、IKKβ的磷酸化表達(dá)有明顯下調(diào)作用(P<0.01)。

Tab 1 Protein interaction network with significant difference extracted via ClusterONE (protein represented using its gene name)

Tab 2 Biaocart signaling pathways mapped on protein interaction network with significant difference

3 討論

本研究中，參麥注射液主要成分蛋白網(wǎng)絡(luò)平均Degree為4.165，不僅表明中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，同時也說明參麥注射液主要成分對網(wǎng)絡(luò)的健康度影響較大。麥冬皂苷作用于含6個蛋白的子網(wǎng)絡(luò)，剔除這6個蛋白后，網(wǎng)絡(luò)度由4.165下降到2.332，平均蛋白連接度下降1.833，表明麥冬皂苷雖然作用的蛋白較少，但是能夠作用于網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵蛋白結(jié)點(diǎn)。

參麥注射液主要成分作用的蛋白包括絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT、PI3K蛋白、絲裂原激酶蛋白家族、熱休克蛋白90、Toll樣受體4等，其參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞代謝與細(xì)胞免疫等作用。而作用的主要信號通路中，p38MAPK信號通路可調(diào)節(jié)腦中水通道蛋白9的表達(dá)，調(diào)節(jié)局部腦缺血[3]。AKT-GSK3-CREB信號通路參與提高腦缺血后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF表達(dá)，保護(hù)腦缺血[4]。Toll 4受體所代表的Toll信號通路，可作用于HMGB-1，參與腦缺血/再灌注作用[5]。NF-κB和TNF信號通路所代表的經(jīng)典炎癥通路[6]，參與炎癥因子的釋放，與缺血性卒中的機(jī)制密切相關(guān)。參麥注射液干預(yù)MCAO模型后，p38、ERK1和IKKβ的表達(dá)降低，證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供先導(dǎo)信息，初步揭示其防治疾病的分子機(jī)制，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研平臺實(shí)驗(yàn)室完成。感謝實(shí)驗(yàn)室老師與全體同學(xué)的大力幫助！)

[1] 陶 麗,范方田,劉玉萍,等.中藥及其組分配伍的整合作用研究實(shí)踐與進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2013, 29(2)：153-6.

[1] Tao L, Fan F T, Liu Y P, et al. Research development on the integration effect of traditional Chinese medicine and its prescriptions[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(2): 153-6.

[2] 張瑩瑩,陳寅螢,王 忠,等.藥物—疾病復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的模塊化解構(gòu)[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2013,29(11)： 1499-502.

[2] Zhang Y Y, Chen Y Y, Wang Z, et al. Modular deconstruction of complex drug-disease networks[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(11): 1499-502.

[3] 吳建華,謝立新,方 芳,等.法舒地爾可能通過PI3K/Akt信號通路抑制大鼠腦缺血/再灌注區(qū)神經(jīng)元的凋亡[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2008, 24(12)：1569-73.

[3] Wu J H, Xie L X, Fang F, et al. Fasudil inhibits neuronal apoptosis after cerebral ischemia/reperfusion injury possibly through the PI3K/Akt signal pathway[J].ChinPharmacolBull, 2008, 24(12): 1569-73.

[4] Clarkson A N,Parker K,Nilsson M,et al.Combined ampakine and BDNF treatments enhance poststroke functional recovery in aged mice via AKT-CREB signaling[J].JCerebBloodFlowMetab,2015,35(8)：1272-9.

[5] Tao X,Sun X,Yin L,et al.Dioscin ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury through the downregulation of TLR4 signaling via HMGB-1 inhibition[J].FreeRadicBiolMed,2015,84：103-15.

[6] Sun B Z,Chen L,Wu Q,et al. Suppression of inflammatory response by flurbiprofen following focal cerebral ischemia involves the NF-κB signaling pathway[J].IntJClinExpMed,2014, 7(9)：3087-95.

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.058.html

2016-10-12，

2016-11-10

江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)課題資助(No 2014A04)

呂燕妮(1986-), 女，博士，主管藥師, 研究方向：臨床藥理學(xué)和藥物不良反應(yīng)監(jiān)測,通訊作者，E-mail：lvyanni@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.029

A

1001-1978(2017)02-0293-02

R-332；R282.71；R284.1；R329.25；R743.310.22