EZH2抑制劑GSK126對Neuro-2a細胞增殖分化的影響及其可能機制

林偉仁，朱 鋒，應榮彪，陳亞天，曾玲暉

(1. 浙江省臺州市腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，浙江 溫嶺 317502；2. 浙江大學城市學院醫(yī)學院藥學研究所，浙江 杭州 310015)

◇研究簡報◇

EZH2抑制劑GSK126對Neuro-2a細胞增殖分化的影響及其可能機制

林偉仁1，朱 鋒2，應榮彪1，陳亞天2，曾玲暉2

(1. 浙江省臺州市腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，浙江 溫嶺 317502；2. 浙江大學城市學院醫(yī)學院藥學研究所，浙江 杭州 310015)

EZH2抑制劑；GSK126；Neuro-2a細胞；mTOR信號通路；凋亡；分化

神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma，NB)是常見的兒童惡性腫瘤，在手術、放化療及介入等多種手段綜合治療下，總體療效仍然極差。近年來研究發(fā)現(xiàn)，果蠅zeste基因增強子同源物2( enhancer of zeste homolog 2，EZH2)能抑制相關抑癌基因，明顯增加神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生、發(fā)展的風險[1]。GSK126是一種新型的選擇性EZH2抑制劑[2-3]，其在實體瘤方面的藥效探究目前相對較少。本文將對GSK126在神經(jīng)母細胞瘤Neuro-2a細胞中的作用及其可能機制作初步探討。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 GSK126(上海瀚香生物科技有限公司)；兔多克隆抗體phosph-mTOR(Ser2448)、phosph-S6(Ser240/244)、mTOR和S6(美國Cell Signaling Technology公司)；流式細胞儀FACSCalibur(美國BD公司)。

1.2 方法 GSK126先溶解于DMSO，保存于-20 ℃，實驗時用培養(yǎng)基稀釋到所需終濃度，低、中、高劑量組分別設定為5、20、50 μmol·L-1。采用SRB法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，以無血清培養(yǎng)細胞觀察GSK126對細胞分化的影響，蛋白印跡法檢測mTOR信號通路相關蛋白的表達。

Tab 1 Cell cycle distribution and apoptotic rate of Neuro-2a cells treated with GSK126

*P<0.05vscontrol group

2 結果

2.1 GSK126對Neuro-2a細胞存活率的影響 GSK126在5～25 μmol·L-1間未顯示明顯的抑制作用，抑制率在10%以下，當濃度增加到50 μmol·L-1時則顯示較強抑制作用，抑制率達到70%以上。

2.2 GSK126對Neuro-2a細胞周期及細胞凋亡的影響 不同濃度GSK126(5、20、50 μmol·L-1)處理細胞后，流式細胞儀檢測結果顯示，5、20 μmol·L-1的GSK126給藥組細胞周期及凋亡比例未發(fā)生明顯改變。但50 μmol·L-1GSK126誘發(fā)明顯的細胞凋亡，且細胞處于G0/G1期及G2/M期的比例明顯下降，細胞生長主要阻滯在S期，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見Tab 1。

2.3 GSK126明顯促進Neuro-2a細胞的分化 10%血清培養(yǎng)對照組細胞一直處于增殖狀態(tài)。無血清培養(yǎng)基對照組培養(yǎng)12 h后，細胞雖有明顯延伸的突起，但突起較細較短，且分化細胞數(shù)(突起長度為胞體直徑2倍以上的細胞)僅占(10.2±1.1)%。而GSK126處理的細胞在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，細胞突起生長明顯，同時胞體直徑明顯變大，低、中、高GSK126劑量組分化細胞分別占(15.2±1.5)% (P<0.05)、(20.3±2.1)%(P<0.05)和(30.4±3.1)%(P<0.01)。

2.4 GSK126能有效抑制Neuro-2a細胞mTOR信號通路活性 在不同濃度GSK126(5、20、50 μmol·L-1)作用下，磷酸化mTOR蛋白與總蛋白的比值分別下降到對照組的81%(P<0.05)、73%(P<0.05)和61%(P<0.01)，磷酸化S6蛋白與總蛋白的比值分別下降到對照組的82%(P<0.05)、67%(P<0.05)和56%(P<0.01)，隨藥物濃度呈劑量依賴性下降。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)GSK126在低濃度下抑制Neuro-2a細胞增殖和促進凋亡的作用并不明顯，但能有效促進細胞分化，并且隨著GSK126藥物濃度的增加，分化細胞的比例亦相應增加。研究表明，EZH2對神經(jīng)細胞特性的維持和細胞分化過程具有調(diào)控作用，與多種神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、分級及治療密切相關[1,4]。由此提示GSK126作為EZH2的抑制劑，可能通過影響神經(jīng)母細胞瘤分化狀態(tài)，進而改變神經(jīng)腫瘤的預后。

在眾多參與神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖分化的細胞信號傳導通路中，mTOR處于樞軸位置。已在神經(jīng)母細胞瘤患者中證實，mTOR 信號病理性激活是病情預后不良的標志[5]，下調(diào)EZH2的表達可抑制mTOR信號的異常激活[6]。本研究表明，隨著EZH2蛋白特異性抑制劑GSK126藥物濃度的增加，mTOR及S6等mTOR信號相關蛋白磷酸化降低，mTOR通路活性下降，且Neuro-2a細胞變大、突起變粗變長、分化細胞的比例相應增加。由此可見，GSK126適度下調(diào)mTOR活性有利于其調(diào)控Neuro-2a細胞分化。本研究中，高劑量GSK126作用下亦可抑制細胞增殖和促進凋亡，這對于Neuro-2a細胞進行分化和維持分化狀態(tài)可能也起到了必不可少的作用。在后續(xù)的研究中，我們將以此為基礎，對GSK126的作用機制，特別是通過調(diào)節(jié)mTOR信號通路調(diào)節(jié)神經(jīng)母細胞瘤分化的具體機制做進一步的探究，以期找到可能的關鍵靶點，從而為神經(jīng)母細胞瘤的治療提供新的方法和策略。

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Effect of GSK126, a novel EZH2 inhibitor, on proliferation and differentiation of Neuro-2a cells

LIN Wei-ren1, ZHU Feng2， YING Rong-biao1, CHEN Ya-tian2, ZENG Ling-hui2

(1.DeptofInternalMedicine,TaizhouCancerHospital,WenlingZhejiang317502,China; 2.DeptofPharmacy,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversityCityCollege,Hangzhou310015,China)

EZH2 inhibitor；GSK126；Neuro-2a cells；mTOR signaling pathway；apoptosis；differentiation

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.054.html

2016-11-16，

2016-12-12

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研資助項目(No 2015KYA148);杭州市科技局重大科技創(chuàng)新資助項目(No 20152013A02)

林偉仁(1971- )，男，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤的診治，E-mail: linweiren1971@163.com； 朱 鋒(1978- )，女，碩士，講師，研究方向：藥理學，共同第一作者，E-mail: zhuf@zucc.edu.cn； 曾玲暉(1972- )，女，博士，教授，研究方向：藥理學，通訊作者，E-mail: zenglh@zucc.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.027

A

1001-1978(2017)02-0289-02

R329.24；R329.25；R730.264；R739.4；R916.4