Angiopoietin—2和Tie—2在人乳腺癌組織中的表達及臨床意義

付傳恒　戶莊　常亮

【摘要】 目的：探討Angiopoietin-2和Tie-2在人乳腺癌組織中的表達及其臨床意義。方法：應用免疫組織化學法檢測乳腺癌組織和正常乳腺組織中Angiopoietin-2和Tie-2的表達情況，并分析其與臨床病理學特征及預后間的相關性。結果：Angiopoietin-2在乳腺癌和正常乳腺組織中的陽性表達率分別為80.99%（98/121）、10.53%（4/38），Tie-2在乳腺癌和正常乳腺組織中的陽性表達率分別為75.21%（91/121）、15.79%（6/38），乳腺癌中Angiopoietin-2和Tie-2的陽性表達率均顯著高于正常乳腺組織（P<0.05）。Angiopoietin-2、Tie-2的表達與病理分期、腋窩淋巴結轉移及預后相關（P<0.05）。結論：Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌組織中呈高表達，其可能成為預測乳腺癌發生發展及預后的生物標志物。

【關鍵詞】 乳腺癌； Angiopoietin-2； Tie-2； 預后

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and clinical significance of Angiopoietin-2 and Tie-2 in human breast cancer.Method：The expressions of Angiopoietin-2 and Tie-2 in breast cancer tissues and normal breast tissues were detected by immunohistochemistry，and their correlation with clinicopathological features were analyzed.Result：The positivity rates of Angiopoietin-2 and Tie-2 in breast cancer tissue were 80.99%（98/121） and 75.21%（91/121），there were significantly higher than those of the adjacent normal tissues （10.53% and 15.79%，P<0.05）.The expression of Angiopoietin-2 and Tie-2 were correlated with pathological stage，axillary lymph node metastasis and prognosis（P<0.05）.Conclusion：Angiopoietin-2 and Tie-2 are highly expressed in breast cancer tissues，which may be biomarkers for predicting the development and prognosis of breast cancer.

【Key words】 Breast cancer； Angiopoietin-2； Tie-2； Prognosis

First-authors address：Huaihe Hospita1 of Henan University，Kaifeng 475000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.32.006

乳腺癌發病率占女性惡性腫瘤的首位，目前其發病機制尚不清楚，但有研究表明乳腺癌的發生及發展與血管生成關系密切，乳腺癌組織中的微血管密度明顯高于正常乳腺組織[1]。血管生成素-2（Angiopoietin-2）主要通過與內皮細胞特異性酪氨酸激酶受體-2（Tie-2）的結合介導血管生成[2]。血管生成不僅為腫瘤細胞的生長提供營養，而且能夠促進腫瘤細胞的遠處轉移。本研究主要通過免疫組織化學方法檢測Angiopoietin-2及其受體Tie-2在乳腺癌中的表達，探討兩者的表達與乳腺癌發生、發展及預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2003年1月-2011年12月在河南大學淮河醫院乳腺外科手術并經組織病理學確診的女性乳腺癌患者121例，全部病例均未行術前放療和化療。年齡26～73歲，平均（53.9±7.8）歲。組織學分型：浸潤性導管癌76例，導管內癌39例，浸潤性小葉癌6例；其中有淋巴結轉移者75例，無淋巴結轉移者46例，臨床分期Ⅰ期21例，Ⅱ期72例，Ⅲ期27例，Ⅳ期1例。同時選擇38例乳腺良性病變中的病變旁組織為正常乳腺組織，經病理學觀察確定為正常乳腺組織。

1.2 方法 兔抗人Angiopoietin-2及Tie-2多克隆抗體及SP免疫組化試劑盒均購自博士德公司，一抗以1∶100稀釋使用。所有標本經甲醛固定后石蠟包埋，4 μm的組織連續切片，經二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，H2O2阻斷內源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽微波高壓抗原修復，然后滴加一抗4 ℃過夜，室溫復溫后滴加二抗并于37 ℃溫箱孵育1 h，DAB顯色，然后蘇木素復染，梯度酒精脫水后封片。采用已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定標準 腫瘤組織染色強度判定：未染色記作0分；輕度染色記作1分；中度染色記作2分；強度染色記作3分。腫瘤組織染色細胞百分比：在高倍鏡下選取陽性最多的區域，記錄5個高倍視野中陽性細胞的百分比，計算其平均值。每個視野染色細胞百分數平均值分為4個級別：0～25%記作0分；25%～50%記作1分；50%～75%記作2分；>75%記作3分。組織染色強度與染色細胞百分比級別之和3～6分為陽性。以上檢測有病理科醫生采用盲法獨立檢測。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌中的表達情況 Angiopoietin-2和Tie-2的陽性染色主要位于細胞漿/細胞膜基質，為淡黃色到棕黃色顆粒細胞漿，在乳腺癌中絕大多數導管上皮細胞顯示強陽性，基質組織不染色；而在正常乳腺組織中細胞不染色或染色細胞數目減少，見圖1。在121例乳腺癌患者中，Angiopoietin-2的陽性表達率為80.99%（98/121），Angiopoietin-2在正常乳腺組織中的陽性表達率為10.53%（4/38）。Tie-2在乳腺癌中的陽性表達率為75.21%（91/121），在正常乳腺組織中的陽性表達率為15.79%（6/38）。研究結果顯示，兩者在乳腺癌中的陽性表達率均高于正常乳腺組織中的陽性表達率，差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.2 Angiopoietin-2和Tie-2的表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系Angiopoietin-2和Tie-2的表達與患者的年齡、分化程度及腫瘤大小均無關（P<0.05），但是與腋窩淋巴結轉移和病理分期相關（P<0.05）。Angiopoietin-2和Tie-2在有淋巴結轉移者中的陽性表達率分別為85.33%（64/75）和82.67%（62/75），均高于其在無淋巴結轉移者的52.17%（24/46）和45.65%（21/46），差異均有統計學意義（P<0.05）。Ang-2、Tie-2在Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌中的陽性表達率分別為85.71%（24/28）和78.57%（22/28），均高于Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌的52.69%（49/93）和50.54%（47/93），差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.3 Angiopoietin-2和Tie-2的表達與乳腺癌患者預后的關系 采用對數秩檢驗（Log-rank test）分析Angiopoietin-2和Tie-2的表達與預后的關系，結果發現Angiopoietin-2陰性的乳腺癌患者生存期顯著高于Angiopoietin-2陽性的患者（P=0.026），見圖2；且Tie-2陽性乳腺癌患者預后較Tie-2陰性患者差，兩者比較差異有統計學意義（P=0.031），見圖3。

3 討論

Angiopoietin-2為分泌型糖蛋白，主要通過與內皮細胞特異性酪氨酸酶受體Tie-2結合而發揮功能。當Angiopoietin-2與內皮細胞上的Tie-2結合時，可引起內皮細胞之間、內皮細胞與支持細胞之間的相互作用減弱，破壞血管結構的穩定性，由此導致毛細血管形成新的血管[3-4]。目前研究發現這兩種在功能上相關的蛋白在肺癌等多種腫瘤中的表達上調并在腫瘤血管形成中起著重要作用[5-6]，但是兩者在乳腺癌組織中表達尚不明確，特別是其與臨床病理特征和預后的關系并不清楚。本研究對Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌中的表達及預后進行了初步探討。

本研究首先觀察Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達情況，結果顯示乳腺癌中Angiopoietin-2和Tie-2的陽性表達率均顯著高于正常乳腺組織（P<0.05），表明兩者可能以協同或互補的方式共同參與乳腺癌的發生過程。目前研究表明，Angiopoietin-2與Tie-2相互作用而參與腫瘤血管的重塑及組織修復的過程，其在腫瘤組織的高表達可能參與腫瘤發生、發展及轉移等[7]。有學者通過動物模型發現Angiopoietin-2轉染促進肺和淋巴結轉移，在肺轉移灶中Angiopoietin-2呈過表達并破壞內皮細胞的完整性，而阻斷Angiopoietin-2后可減少淋巴結、肺轉移和腫瘤淋巴管生成[8]。Imanishi等[9]研究表明Angiopoietin-2和Tie-2上調不但促進乳腺癌細胞的生長和轉移并且在轉移發生的啟動階段起關鍵作用。而本研究結果顯示，在淋巴結轉移乳腺癌患者中Angiopoietin-2和Tie-2的陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移患者（P<0.05），并且兩者與乳腺癌的分期相關，提示兩者在乳腺癌的發生及發展過程中可能起重要作用，可以作為判斷乳腺癌惡性程度的指標，本研究結果與在腎癌、結腸癌及卵巢癌中的研究一致[10-12]。

有研究發現靶向抑制Ang-2/Tie-2可減少腫瘤的轉移和抑制腫瘤的生長，Ang-2 是未來的治療腫瘤的靶點[13-14]。Han等[15]研究發現乳腺癌組織中Angiopoietin-2的高標表達與患者的生存期降低有關。本研究進一步對Angiopoietin-2和Tie-2與乳腺癌生存期的關系進行了初步探討，結果表明對Angiopoietin-2陽性的乳腺癌患者生存期顯著高于Angiopoietin-2陰性的乳腺癌患者（P<0.05），并且Tie-2陽性的乳腺癌患者生存期顯著高于Tie-2陰性的乳腺癌患者（P<0.05），這一結果支持這兩種因子是預測乳腺癌預后的生物學標志物。

綜上所述，本研究結果表明Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌發生發展過程中起重要作用，兩者可以作為預測乳腺癌預后的生物學標志物，有望成為乳腺癌治療的新靶點。

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（收稿日期：2016-09-18） （本文編輯：程旭然）