ZnPcS2P2介導的光動力療法誘導HL—60細胞凋亡的分子機制

趙曉燕　成玲　黃慧芳

【摘要】 目的：探討ZnPcS2P2介導的光動力學療法（ZnPcS2P2- PDT）誘導HL-60細胞凋亡的分子機制。方法：應用DNA倍體分析檢測ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞細胞周期的影響，應用RT-PCR方法檢測ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞Bcl-2、C-myc、人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）與Fas等基因mRNA表達的影響。結果：ZnPcS2P2-PDT阻止HL-60細胞從G1期進入S期，使細胞阻滯在G1期；并出現凋亡峰。ZnPcS2P2-PDT處理后，HL-60細胞中Bcl-2、C-myc與hTERT等基因mRNA表達水平顯著下降，而Fas基因的mRNA表達水平上升。結論：ZnPcS2P2-PDT可將HL-60細胞阻滯在G1期，誘導細胞凋亡，可能通過下調Bcl-2、C-myc與hTERT，上調Fas基因表達而發揮作用。

【關鍵詞】 酞菁鋅； 光動力學療法； 凋亡； HL-60細胞

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.31.007 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2016）31-0014-03

【Abstract】 Objective：To study of the molecular mechanisms of ZnPcS2P2 mediated light therapy （ZnPcS2P2-PDT） induced HL 60 apoptosis.Method：The effects of ZnPcS2P2-PDT on HL-60 cells，cell cycle were determined by DNA analysis detected by flow cytometry.The expression of Bcl-2，C-myc，hTERT（human telomerase reverse transcriptase）and Fas mRNA were detected by RT-PCR.Result：HL-60 cells were stopde from G1 phase to S phase by ZnPcS2P2-PDT， the cell were blocked in G1 phase，and appeared apoptosis phase.The mRNA expression level of Bcl-2，C-myc and hTERT decreased significantly after ZnPcS2P2-PDT.The mRNA expression of Fas increased significantly after ZnPcS2P2-PDT. Conclusion：ZnPcS2P2-PDT could arrest HL-60 cells at G1 phase and induce apoptosis by reducing the mRNA expression level of Bcl-2，C-myc and hTERT，and up-regulating the mRNA expression of Fas.

【Key words】 Zine phthalocyanine Photodynamic therapy； Apoptosis； HL-60 cells

First-authors address：Fujian Provincial Maternity and Childrens Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350001，China

光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種發展中的腫瘤治療新方法[1]。PDT對腫瘤細胞作用的基本原理為：光敏劑接受特定波長光的光能后，通過光化學反應和能量傳遞過程將光能轉化為分子內能，在有氧條件下，產生多種活性氧物質（ROS），ROS對生物大分子產生破壞作用，使細胞的結構和功能受到嚴重影響，從而干擾腫瘤細胞的生長并導致其死亡，以達到治療目的[2]。本課題組前期研究結果表明ZnPcS2P2介導的光動力學療法（ZnPcS2P2-based-photodynamic therapy，ZnPcS2P2-PDT）對白血病細胞有顯著的選擇性殺傷作用、較好的凈化效果[3]，并可誘導白血病細胞發生線粒體相關凋亡[4]。本研究將從分子水平上初步探討ZnPcS2P2-PDT對白血病HL-60細胞的殺傷機制，為從分子水平調節白血病細胞凋亡、增強PDT的抗白血病效應提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 光敏劑ZnPcS2P2

由福州大學化學系黃金陵、陳耐生教授提供，事先將ZnPcS2P2溶于溶劑，溶劑組成為Cremophor EL 2%（V/V），1，2丙二醇20%（V/V），NaCl 0.9%（W/W）。避光，4 ℃保存。用生理鹽水稀釋成系列濃度即為即用型。

1.2 細胞系及培養體系

HL-60細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。培養條件：含10%滅活胎牛血清（杭州四季青生物制品研究所），2 mmol/L L-谷氨酰胺，常規劑量青、鏈霉素的RPMI-1640培養液（GIBCO BRL）， 置37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養箱中培養， 隔天半量換液。細胞為對數生長期，存活細胞百分率（臺盼蘭拒染法）>95%， 以備實驗。

1.3 ZnPcS2P2-PDT處理細胞

用RPMI1640培養液重懸HL-60細胞，細胞密度為5×106/ml， 加入終濃度為0.5 μg/ml的ZnPcS2P2，孵育5 h后光照。同時設立空白對照組、光照對照組（單純光照）、光敏劑對照組（單純與0.5 μg/ml ZnPcS2P2共孵育，不光照）。光照條件：由LD-670半導體激光機（由天津醫科大學激光醫學研究室研制）輸出的670 nm激光以53 mW/cm2的功率密度、2.1 J/cm2的能量密度照射。于光照后6、12、24 h收集細胞。

1.4 DNA倍體分析檢測ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞細胞周期的影響

細胞用PBS洗滌后，用Kenesis 50試劑（Bio-Rad）染色，置流式細胞儀（美國BD公司）檢測，應用Cell modifit軟件分析細胞周期。

1.5 ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞bcl-2、c-myc、hTERT與Fas等基因mRNA表達的影響

應用TRIZOl（Life Technology）提取各組細胞總RNA，所提取的RNA OD260 ： OD280>1.8，經電泳可見明亮清晰的18 s與28 s

兩條rRNA帶，說明RNA完整。cDNA合成及擴增體系參見文獻[5]。所用試劑均來自Promega公司產品。以β-actin為內參照，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀（Gel Doc 1000型，Bio-Rad）分析，比較各組擴增產物熒光強度。所用引物由上海生物工程公司合成，引物序列、片段長度及退火溫度見表1。

1.6 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件處理數據，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞周期的影響

ZnPcS2P2-PDT處理后，隨著繼續孵育時間的延長，G0/G1期的HL-60細胞比例逐漸升高，上升幅度越來越明顯；于6 h出現了凋亡峰（Sub G1），隨后該峰逐漸明顯，24 h達到（22.75±3.96）%，差異有統計學意義（P<0.05）；S期的細胞由（67.69±0.45）%降到（42.63±1.23）%， 差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.2 ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞Bcl-2、C-myc、hTERT和Fas mRNA表達的影響

在任何時間段，各基因mRNA的表達水平在三個對照組HL-60細胞中表達相似。ZnPcS2P2-PDT處理HL-60細胞后，Bcl-2、C-myc和hTERT的mRNA表達下調，而Fas mRNA表達上調。Bcl-2 mRNA表達于PDT處理后12 h時，下降較明顯；C-myc也是于12 h時有明顯減弱，24 h時更顯著；hTERT在6 h時就減弱，24 h時減弱最顯著。Fas mRNA表達水平于ZnPcS2P2-PDT處理后6 h就有較明顯增強，見圖1。

3 討論

凋亡相關基因的表達在腫瘤的發生發展中起重要的調控作用，其中某些基因發生缺失或過度表達可導致細胞增殖失控或凋亡受阻，并產生抗藥性。因此，如何調控凋亡相關基因或其相應產物的表達提高腫瘤細胞對干預因素的敏感性、誘導細胞凋亡，是腫瘤治療取得成功的關鍵。目前，研究較多的凋亡相關基因包括Bcl-2、C-myc、hTERT和Fas等。本研究從分子水平上初步探討ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞內一些凋亡相關基因mRNA 表達的影響，為從分子水平調節白血病細胞凋亡、增強PDT的抗白血病效應提供實驗依據。

本研究結果顯示ZnPcS2P2-PDT處理后，G0/G1期的HL-60細胞比例明顯增高、S期的細胞比例下降，ZnPcS2P2-PDT處理后出現凋亡峰，上述結果表明ZnPcS2P2-PDT阻止細胞從G1期進入S期，使細胞阻滯在G1期，并發生細胞凋亡。許多血液系統惡性腫瘤高表達Bcl-2。Bcl-2基因是一種敏感的PDT光損傷目標[6]，PDT可使Bcl-2基因發生裂解和交聯而被破壞。本研究結果顯示Bcl-2mRNA表達于PDT處理后顯著下降， C-myc原癌基因參與細胞周期G1/S時相轉換的調控，HL-60細胞C-myc 表達水平高出正常細胞10倍，本研究結果表明ZnPcS2P2-PDT可在轉錄水平上抑制C-myc基因表達，因此推測C-myc基因也是ZnPcS2P2-PDT抑制HL-60細胞增殖、誘導細胞凋亡的調控點。端粒酶具有抗凋亡作用， 端粒酶激活是細胞永生化和腫瘤生成的重要步驟，抑制其活性可以誘導細胞的凋亡[7]；hTERT是端粒酶的組成成分之一，其表達與端粒酶活性密切相關，是端粒酶活性表達的唯一限制性組分。本研究結果顯示HL-60細胞hTERT mRNA表達顯著受抑。提示ZnPcS2P2-PDT可能通過抑制hTERT基因的表達降低端粒酶的活性，從而促進HL-60細胞凋亡。另有資料表明，C-myc可誘導hTERT基因表達而激活端粒酶[8]。本研究結果還顯示ZnPcS2P2-PDT可明顯上調Fas基因表達，提示ZnPcS2P2-PDT也可能通過啟動Fas/FasL細胞凋亡途徑而抑制HL-60細胞增殖。筆者將進一步研究Caspase-8在ZnPcS2P2-PDT誘發的細胞凋亡中的作用，揭示Fas/FasL途徑在ZnPcS2P2-PDT抗白血病過程中所發揮的作用。

參考文獻

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（收稿日期：2016-07-23）