武威市某鎮乙型肝炎感染者家庭內部隱匿性感染現狀及其分子進化特征

溫小輝,蒲中樞,王 洋,付 婷,成慧娟,蘇海霞,邵中軍

武威市某鎮乙型肝炎感染者家庭內部隱匿性感染現狀及其分子進化特征

溫小輝,蒲中樞,王 洋,付 婷,成慧娟,蘇海霞,邵中軍

目的 研究武威市某鎮乙型肝炎病毒(HBV)家庭內部感染者中隱匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection, OBI)的流行現狀及其分子進化特征。方法 以2009年武威市某鎮體檢發現的HBsAg陽性者為先證者，詢問其家族史，簽署知情同意書后，對此家庭內部人員進行流行病學調查，收集血樣。采用ELISA檢測HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc；對所有血清樣本用病毒DNA磁珠法試劑盒提取，而后巢式PCR擴增S區獲得HBVDNA片段，測序后應用mega6.0進行進化樹分析。結果 共收集血清學標本80份；HBsAg、抗-HBc、HBVDNA的陽性率分別為43.8%、78.8%、37.5%；OBI共有12例，感染率是26.7%(12/45)。結論 在HBV感染家庭中，家庭內部OBI陽性率明顯高于一般人群，基因型主要是C型、D型，其中基因型D型居多。

乙型肝炎病毒；隱匿性感染；分子進化

慢性乙型肝炎是我國常見的慢性傳染病之一，全球約20億人曾感染過乙型肝炎病毒(HBV)，其中3.5億人為慢性HBV感染者[1]。乙型肝炎感染者的篩查主要靠HBsAg這一指標，而隱匿性感染(occult hepatitis B virus infection, OBI)由于其HBsAg陰性很難發現，給患者造成很大的危害；隨著分子生物學技術的發展，越來越多的患者被檢出，其意義也受到重視。OBI是指HBsAg陰性而血清或肝組織中DNA陽性[2]。OBI主要與抗原突變逃逸、宿主狀態相關[3]，其與肝硬化、肝癌密切相關[4-7]，因此其研究值得關注。而對于家庭內部OBI的研究目前還比較少。筆者主要針對HBV感染者家庭OBI的研究從而為乙型肝炎家庭內部人群的預防和治療等提供一定的指導。

1 對象與方法

1.1 對象 以2009年武威市某鎮體檢發現的HBsAg陽性者為先證者，調查其家庭成員。納入標準：(1)先證者的所有直系家庭成員；(2)家庭成員近5年生活在同一個住所。排除標準：(1)采血時不在本地不能進行采血的人員；(2)患有甲型肝炎、丙型肝炎等其他傳染病的人員；(3)患有肝硬化、肝癌的人員。OBI 的判定標準：經商業試劑盒檢測HBsAg陰性，巢式PCR擴增樣本血清HBV DNA結果陽性。

1.2 調查內容 詢問其家族史，簽署知情同意書后，調查人員統一進行培訓，調查內容包括一般狀況、HBV感染史、臨床病史、飲酒史、家族史及與先證者的親屬關系，每位成員抽取靜脈血5 ml，2000 r/min離心20 min后，取血清置于-80℃備用。

1.3 血液檢測方法 用ELISA法檢測HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe、Anti-HBc，商業試劑盒購自北京萬泰生物工程公司。對所有的血清樣本用病毒DNA磁珠法提取試劑盒(長春市志昂生物科技有限公司)提取DNA，而后進行巢式PCR擴增，PCR反應條件：PCR反應引物外引物為S1：5′CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC3′，S2：5′ATACCCAAAGACAAAAGAAA-A3′； 內引物為S3：5′GCGGGGTTTTTCTTGTTGAC3′，S4：5′GGGACTCAAGATGTTGTACAG3′，引物由上海尼桑生物科技有限公司合成。外引物以第一輪反應體系進行，第一輪PCR擴增，PCR參數：94 ℃變性30 min，55 ℃退火50 min和72 ℃延伸1 min，循環周期結束后在72 ℃孵化5 min以確保充分延伸。以第一輪產物為模版，以內引物進行第二輪PCR擴增，PCR參數與第一輪參數相同。每輪PCR均設陰性對照。擴增產物為S區，長度584 bp。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，紫外線條件下觀察陽性結果，送上海尼桑生物科技有限公司進行雙向測序。對測得的HBV片段序列與參比序列應用MEGA6.0進行基因序列分析。依據genbank已發表的人類HBV基因序列，用美國國家生物技術信息中心(NCBI)服務器中的BLAST菜單進行同源性檢索以確定標準的HBV基因。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0分析，計數資料用χ2檢驗和Fisher確切概率法，計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清學特征分析 發現先證者27例，涉及27個家庭，樣本共計80例(男39名，女41例)，進而實驗發現HBsAg陽性者共35例，陽性率是43.8%，占陽性人群的71.4%。Anti-HBs陽性者63例，陽性率是78.8%。HBeAg陽性者3例，陽性率3.8%，Anti-HBe陽性者24例，陽性率是30%，anti-HBc陽性者63例，陽性率是78.8%。HBsAg陰性者45例，其中OBI有12例，發生率26.7%。OBI人群與慢性乙型肝炎攜帶者人群特征比較，Anti-HBs陽性率和Anti-HBe 在兩個人群中有差別，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 家庭內部成員OBI感染人群和乙型肝炎攜帶者人群特征 [±s;(n;%)]

2.2 基因型、血清型和進化特征分析 OBI病例中，C基因型4例，D基因型8例，最大似然法HBV隱匿性感染系統進化樹見圖1。血清型adrq+4例，ayw38例。慢性乙型肝炎攜帶者中B基因型4例，C基因型5例，D基因型9例。血清型adw24例，ayw29例，adrq+5例。

圖1 最大似然法HBV隱匿性感染系統進化樹

標本前面的阿拉伯數字代表著Bootstrap值，值越大代表病毒株之間的親緣性越近，J68、J67、J62、J34、J45、J42、J55、J58與HBVD基因型標準株進化距離近，可以認為屬于HBV基因型D；J21、J31、J35、J76與HBVC基因型標準株進化距離近，認為屬于HBV基因型C

2.3 OBI基因突變分析 分析OBI樣本S區顯示：與T細胞表位相關的突變包括J34發生T123I突變，J42發生A166G突變，J55、J58發生Q101R、I110L、T189I突變，J62、J67、J68發生P120T突變，J67、J68發生G185W突變。與a共同決定簇相關的變異包括J34發生Y134N突變，J45發生Y134K突變,J42、J62、J67、J68發生T140I突變。6個樣本發生a共同決定簇相關基因位點突變，占50%。同時本實驗中C基因型沒有a共同決定簇相關基因位點突變(圖2)，8個D基因型樣本中發生突變6個a共同決定簇相關基因位點突變，占75%(圖3)。

圖2 隱匿性乙型肝炎感染基因型C氨基酸位點突變

圖3 隱匿性乙型肝炎感染基因型D氨基酸位點突變

3 討 論

我國屬于HBV的高流行地區。何英利等[8]發現，HBsAg陽性率是45.6%，而張振華等[9]研究的關于家族史人群的OBI陽性率為8.0%。顏丙玉等[10]對山東省社區人群OBI的研究發現感染率是0.82%。一項對廣西壯族自治區隆安縣家庭內部感染者的研究發現，OBI陽性率是11.5%[11]。武威市最近的一次流行病學調查發現， HBsAg陽性率是7.19%，明顯高于全國平均水平[12]。筆者調查的武威市某鎮家庭內部人群HBsAg的陽性率是43.8%，OBI陽性率是26.7%，明顯高于一般人群。OBI人群Anti-HBs陽性率91.7%，慢性乙型肝炎攜帶者Anti-HBs陽性率27.8%，兩組人群具有統計學差異。說明Anti-HBs的存在或許可以抑制病毒DNA在體內的復制，影響機體對病毒的清除，從而造成HBV病毒DNA在體內的低水平持續存在。

基因型有明顯的地域和種族特征，A、D主要分布在美國和歐洲，基因型B、C主要分布在東亞及東南亞，E型多分布在非洲，F型多分布在南美洲、法國，G型僅在法國和美國，H型主要是拉丁美洲南部、中美洲等地，這種地域分布在一定程度上反映了HBV的起源和傳播[13]。中國的乙型肝炎基因型主要有B型、C型[14]。本研究中家系人群HBV DNA發現的主要基因型是C型、D型，而D型最多。主要原因可能是武威地處河西走廊屬多民族聚集區，歷史上又是絲綢之路必經之路，移民較多。

本次實驗中，OBI人群中與a共同決定簇相關的突變有T126A、Y134N、T140、ST140I、S143L，其中有兩個樣本分別發生T140I、S143L突變。6個樣本發生基因位點突變，占總樣本的50%(6/12)，且發生突變株都屬于基因型D，占基因型D的75%(6/8)，說明OBI中基因型D比基因型C更易發生突變。有研究表明S區aa145變異是表面抗原逃逸突變的主要原因[15]，同時144、143、142、141、137、133、127、120、124、126、129位點突變也影響表面抗原的形成[16]。本次研究中新發現134、140位點發生突變，這些位點或許參與了表面抗原的逃逸突變。

總之，在乙型肝炎家庭內部感染中，OBI的流行病學資料有其自身特點，而武威市屬于多民族聚集區和古絲綢之路的重要城市，由于其獨特的地域、民族特色，OBI更增添了其特殊性。家庭內部OBI陽性率明顯高于一般人群，需要乙型肝炎患者家庭成員有針對性地做好相關預防措施。

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(2016-07-20收稿 2016-11-15修回)

(責任編輯 武建虎)

The status quo and molecular evolution of occult infection in intrafamilial patients with hepatitis B virus infection in Wuwei

WEN Xiaohui, PU Zhongshu, WANGY Yang, FU Ting, CHENG Huijuan, SU Haixia, and SHAO Zhongjun.

Department of Epidemiology, Department of Preventive Medicine, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

Objective To study the status quo and molecular evolution of occult infection in intrafamilial patients with hepatitis B virus infection in the city of Wuwei.Methods All the people who were found to be infected with HBsAg during a physical examination in 2009 in a town in Wuwei were questioned for their HBV family history. After they signed informed consent, their blood was drawn and tested for hepatitis B surface antigen (HBsAg), antibody to HBsAg (anti-HBs), hepatitis B e-antigen (HBeAg), antibody to HBe (anti-HBe) and antibody to hepatitis B core antigen (anti-HBc) using commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). DNA was extracted using magnetic Beads extraction kit from all the samples, and amplification was performed by nested PCR. Sequences obtained were analyzed by mega 6.0.Results Of the 80 serum samples, the positive rate of HBsAg, Anti-HBc, and HBV DNA was 43.8%, 78.8% and 37.5%, respectively. The rate of infection with intrafamilial occult hepatitis B was 26.7%(12/45).Conclusions The prevalence of intrafamilial occult hepatitis B infection is significantly higher than in the general population. The main genotype is genotype C and genotype D in particular.

hepatitis b virus; occult virus infection；molecular evolution

國家自然科學基金(81373058，81370082)

溫小輝，碩士研究生，醫師。

710032 西安，第四軍醫大學預防醫學系流行病學教研室

邵中軍，E-mail：zhjshao@vip.163.com

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