PKA信號通路影響D-半乳糖誘導老化心肌細胞舒張功能障礙的機制

劉靜 郭妍

PKA信號通路影響D-半乳糖誘導老化心肌細胞舒張功能障礙的機制

劉靜 郭妍

目的 探討D-半乳糖誘導老化的心肌細胞舒張功能障礙的機制。 方法 實驗用藥物預處理后予以D-半乳糖建立鼠心肌細胞老化模型。分為4組:正常對照組(C組)、D-半乳糖組(D-G組)、cAMP依賴蛋白激酶A(PKA)預激動組(D-G+cAMP組)和PKA預抑制組(D-G+H-89組);測定心肌細胞肌漿網鈣攝取能力,肌漿網Ca2+-ATP酶(SERCA,心臟主要是SERCA2a)活性以及Western blot 檢測第16 位絲氨酸磷酸化受磷蛋白(Ser16phosphorylated phospholamban,Ser16-PLN)的含量。 結果 與C組相比,D-G組、D-G+H-89組舒張期鈣離子濃度[([Ca2+]i)D]升高,鈣離子回攝時間(tβ)延長,給予咖啡因刺激后,鈣離子增幅(△[Ca2+]i)減少;細胞內SERCA2a活性下降以及Ser16-PLN表達下調(P<0.05)。 與D-G組相比，D-G-H-89組([Ca2+]i)D水平進一步升高，tβ進一步延長，給予咖啡因刺激后，△[Ca2+]i明顯降低，SERCA2a活性下降，Ser16-PLN表達下調。而D-G+cAMP組([Ca2+]i)D水平明顯降低， tβ縮短，△[Ca2+]i增高，細胞內SERCA2a明顯提高，Ser16-PLN表達增加。 結論 D-半乳糖可能是通過抑制PKA通路,下調Ser16-PLN的磷酸化水平,增加對SERCA2a活性的抑制,從而引起老化心肌細胞舒張功能障礙。

蛋白激酶A; Ser16-PLN； 肌漿網Ca2+-ATP酶； 肌漿網鈣失調; 心肌老化

舒張性心力衰竭(DHF)最常見于老年病人和糖尿病、高血壓、肥胖等人群。DHF的主要原因是心臟衰老,隨著年齡增長導致心臟泵功能的急劇下降,從而導致舒張功能障礙[1]。心肌細胞內鈣失衡是心肌收縮舒張功能失調的共同原因。肌漿網(sarcoplasmic reticulum,SR)是哺乳動物心臟細胞內最重要的儲存鈣庫,參與心臟收縮舒張的鈣循環過程[2]。收縮期鈣釋放通道蘭諾丁受體(ryanodine receptor,RyR)將SR內大量儲存Ca2+釋放進入胞漿,舒張期心肌細胞在受磷蛋白(phospholamban,PLN)的調節下,肌漿網Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+/-ATPase,SERCA)消耗ATP主動將Ca2+攝入SR[3-5]。心肌細胞內主要存在3條磷酸化通路調節心肌細胞鈣轉運蛋白功能,分別是cAMP依賴蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase A,PKA) 、鈣-鈣調素依賴蛋白激酶Ⅱ (Ca2+-calmodulin dependent kinase Ⅱ, Ca2+-CaMKⅡ)及蛋白激酶C(protein kinase C, PKC) 信號通路。其中前2種途徑被認為占主要作用。PKA是一種cAMP依賴性蛋白激酶,當cAMP含量增加時,PKA 被激活并從第16 位絲氨酸(Ser16)磷酸化PLN,從而解除對SERCA2a 的抑制,增強SERCA2a 的活性,從而改善心肌舒張功能障礙[6]。

D-半乳糖衰老模型的原理是D-半乳糖與蛋白質和肽中氨基酸的游離胺在體外和體內反應,引發非酶糖基化反應,形成晚期糖基化終產物(AGEs),其反應產物可進一步誘導自由基損傷,放大非酶糖基化效應,從而導致心肌細胞舒張功能減退[7]。我們前期的動物模型已證實了這一過程,本實驗在細胞水平,繼續以D-半乳糖誘導乳鼠心肌細胞衰老模型,并給予PKA信號通路的激活劑和抑制劑干預該信號通路,通過觀察衰老心肌細胞SR鈣攝取功能以及Ser16磷酸化PLN蛋白的表達,尋找D-半乳糖致心肌細胞衰老作用的胞內上游信號傳導途徑。

1 材料和方法

1.1 材料 SD乳大鼠(出生3 d內)由南京醫科大學實驗動物中心提供,動物合格證號:SCxK(蘇)20020031。D-半乳糖、咖啡因、牛血清白蛋白(Sigma);DMEM培養基(GIBCO);胎牛血清(杭州四季青公司);Fura-2/AM(Invitrogen);細胞裂解液(碧云天公司,P0013B);H-89(LC Labs, Woburn, MA);cAMP(Santa Cruz,sc201564);兔抗鼠p-PLN(Ser16)抗體(abcam, ab15000 1:1000);辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗(abcam,ab6721 1:5000);蛋白Marker(Fermentas);PVDF膜(millipore);Supersignal West Pico-blot化學發光底物(ECL液)(Pierce)。

1.2 方法

1.2.1 原代乳鼠心肌細胞分離和培養:乳大鼠心室肌細胞的培養參照Xu等[8]的方法,無菌條件下將出生1～3 d SD乳大鼠心臟取出,留取心室,充分剪碎,多次0.06%胰酶消化完全后,差速貼壁法去除大部分成纖維細胞,隨后用含20%新生牛血清及100 U/ml青霉素/鏈霉素的DMEM培養液將心肌細胞懸浮,以(3～4)×106/cm2接種于六孔板,37 ℃,5% CO2培養箱中培養, 48 h后可見心肌細胞成團搏動后待用。

1.2.2 實驗分組和干預:將培養48 h后的原代心肌細胞分為4組:正常對照組(C組),正常培養的心肌細胞,未予任何干預; D-半乳糖組(D-G組),正常培養心肌細胞,培養48 h后,加入5 g/L D-半乳糖;PKA預激動處理組(D-G+cAMP組),在D-半乳糖誘導老化前2 h加入終濃度為1 μmol/L的PKA激動劑cAMP; PKA預抑制處理組(D-G+H-89組),在D-半乳糖誘導老化前2 h加入終濃度為10 μmol/L的PKA抑制劑H-89;各組處理完后繼續培養24 h收集細胞進行指標測定。

1.2.3 Fura-2/AM熒光測定心肌細胞SR游離鈣離子濃度:SR鈣負荷Fura-2/AM 熒光測定[Ca2+]i的方法和濃度計算參照文獻[9]。在激光共聚焦培養皿中,用Fura-2/AM熒光37 ℃孵育心肌細胞30 min后,選擇搏動的心肌細胞,由圖像放大的CCD(TILL成像系統,德國)采集細胞的熒光圖像,并傳送到計算機分析系統(Imaging Software Till 4.0)。測定發射波長340 nm與380 nm時細胞內平均熒光強度值,該比率(F340/380)被用來表示細胞內[Ca2+]i,同時扣除背景的影響。繼續用Fura-2/AM熒光37 ℃孵育另一批心肌細胞30 min后,選擇搏動的心肌細胞,在共聚焦培養皿中,快速加入10 mmol/L咖啡因5 μl,測定[Ca2+]i。

([Ca2+]i)D為舒張期細胞內[Ca2+]i(基線的平均值);SR鈣回攝時間tβ為[Ca2+]i由峰值下降至基線所需的時間,([Ca2+]i)B為加入咖啡因10 mmol/L前[Ca2+]i的平均值;([Ca2+]i)max為加入咖啡因后[Ca2+]i的最高值,△[Ca2+]i(%)=[([Ca2+]i)max-([Ca2+]i)B]/([Ca2+]i)B×100%。至少有3批獨立的實驗,每批實驗至少測量20個單個細胞。

1.2.4 SERCA2a 活性檢測:SERCA2a 活性檢測采用改良的4-硝基酚磷酸二鈉(p-NPP)法[10]。收集4組培養的心肌細胞,加入4 ℃的勻漿緩沖液(20 mmol/L Hepes,2 mmol/L EDTA,250 mmol/L 蔗糖),12 000 r/min離心20 min 后收集上清進行蛋白定量及SERCA2a活性檢測。10 μl上清液加入80 μl反應體系(1.25 mmol/L MgCl2,0.00125% TritonX-100,0.125 mol/L KCl,1.25 mmol/L EGTA,10 mmol/L Hepes,含或不含1 mmol/L CaCl2)中,37 ℃孵育10 min 后加入100 mmol/L p-NPP 10 μl,再孵育30 min 后加入100 μl反應終止液(500 mmol/L Tris,55 mmol/L EDTA),用分光光度計在波長405 nm 處閱讀反應產生的4-硝基酚(p-NP)光密度值,并通過p-NP 標準曲線進行換算。SERCA2a 活性用每分鐘每克蛋白產生的p-NP 的微摩爾數[μmol/(g·min)]表示。

1.2.5 Western blotting 檢測Ser16-PLN蛋白表達量:用細胞裂解液提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(上樣量為30 μg,30 mA恒流電泳),轉膜(200 mA恒流電轉),5%脫脂牛奶37 ℃搖床封閉2 h,一抗(Ser16-PLN)抗體1:1000, 37 ℃振動反應2 h,TBST緩沖液洗膜10 min×3次,二抗37 ℃搖床孵育2 h,TBST緩沖液洗膜10 min×3次,ECL發光液5 min,曝光。UVI自動成像分析系統(Bio-Rad公司)掃描采集圖像,Gel-Pro Analyzer 軟件分析Ser16-PLN蛋白和內參GAPDH的顯色灰度比值,半定量檢測。

2 結果

2.1 D-半乳糖誘導老化的心肌細胞SR鈣攝取能力 與正常對照組比較,D-G組、D-G+H-89組([Ca2+]i)D水平明顯升高,tβ明顯延長,再給予咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯降低,而D-G+cAMP組無明顯差異;與D-G組比較,D-G+H-89組([Ca2+]i)D水平進一步升高,tβ進一步延長,再給予咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯降低,而D-G+cAMP組([Ca2+]i)D水平明顯降低,tβ明顯縮短,咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯增高,說明D-半乳糖可通過抑制PKA信號通路,使舒張期心肌細胞內鈣超載,肌漿網攝取鈣能力及鈣離子儲備能力顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 心肌細胞舒張期鈣離子濃度、鈣離子回攝時間及鈣瞬變增幅

注:與C組比較,*P<0.05;與D-G組比較,△P<0.05

2.2 D-半乳糖誘導老化的心肌細胞SERCA2a活性 與C組比較,D-G組、D-G+H-89組SERCA2a 活性均明顯降低,D-G+cAMP組無明顯差異;與D-G組比較,D-G+H-89組SERCA2a 活性進一步降低,D-G+cAMP組SERCA2a明顯提高(P<0.05),見圖1。

注:與C組比較,*P<0.05;與D-G組比較,△P<0.05圖1 心肌細胞SERCA2a 活性檢測(n=5)

2.3 D-半乳糖對心肌細胞Ser16-PLN蛋白表達的影響 與C組比較,D-G組、D-G+H-89組Ser16-PLN蛋白表達量分別下降約54%和65%,差異有統計學意義(P<0.05),與D-G+cAMP組比較,D-G、D-G+H-89組Ser16-PLN蛋白表達量分別下調51%和63%,差異有統計學意義(P<0.01),見圖2。

A:Ser16-PLN 及GAPDH 蛋白Western blot 檢測條帶;B:Ser16-PLN 蛋白半定量結果注:與C組比較,*P<0.05;與D-G+cAMP組比較,△P<0.05圖2 心肌細胞Ser16-PLN 蛋白表達變化(n=5)

3 討論

目前心肌細胞老化機制尚未完全闡明, 但可能與非酶糖基化反應有關。非酶糖基化反應是還原糖和生物大分子在沒有酶參與的條件下自發地與葡萄糖及其它還原糖反應,形成早期糖基化產物,再進一步反應生成AGEs[11]。有研究報道,AGEs增多可通過破壞細胞內鈣平衡、活化信號轉錄子和轉錄激活子及信號通路等作用促使心肌細胞老化[12]。D-半乳糖是一種還原糖,我國學者王琳早在2005年就用D-半乳糖誘導心肌細胞衰老并成功建立離體心肌細胞的衰老模型[13]。本課題組在前期細胞水平實驗中已證實,D-半乳糖組的AGEs含量比正常對照組增加了7倍,提示D-半乳糖誘導可促進心肌細胞的非酶糖基化反應,從而導致心肌細胞衰老。課題組進一步研究發現,老化組的鈣攝取能力明顯下降,說明老化的心肌細胞SR受到一定程度的損壞,且機制可能與下調SERCA2a 的活性及表達有關[14],但尚無關于SERCA2a 上游調控機制的研究。因PKA信號通路可以通過Ser16磷酸化PLN,進而增強SERCA2a 的功能,故本研究欲證實D-半乳糖是否是通過PKA信號途徑調控SERCA2a,導致SR鈣攝取能力降低,進一步引起心肌細胞舒張功能障礙。

本實驗通過D-半乳糖建立心肌細胞老化模型,探討在D-半乳糖致衰老心肌細胞舒張功能障礙中PKA信號通路的調節作用。結果發現,與C組相比,D-G組、D-G+H-89組([Ca2+]i)D水平明顯升高,tβ明顯延長,再給予咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯降低,而D-G+cAMP組無明顯差異;與D-G組相比,D-G+H-89組([Ca2+]i)D水平進一步升高,tβ進一步延長,再給予咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯降低,而D-G+cAMP組([Ca2+]i)D水平明顯降低,tβ明顯縮短,咖啡因刺激后,△[Ca2+]i(%)明顯增高。這與Petrova等[15]在過度表達RAGE的轉基因小鼠模型上的發現有一致性,而我們的實驗在細胞水平上進一步證實了老化心肌細胞可通過抑制PKA信號通路,使SR鈣攝取能力及鈣離子儲備能力顯著降低,SR受到一定程度的損壞。

接著,我們進一步檢測SERCA2a的活性及PLN的磷酸化信號通路,選擇PLN最主要的磷酸化位點Ser16,利用特異性磷酸化位點的抗體,計算磷酸化PLN的蛋白含量。我們發現,與C組相比, D-G組、D-G+H-89組SERCA2a 活性和Ser16-PLN蛋白表達量均明顯降低,而D-G+cAMP組明顯提高D-半乳糖降低的心肌細胞內SERCA2a的活性和Ser16-PLN蛋白表達量。由此,我們可以初步得出結論:PKA信號通路是參與心肌老化的一個重要過程,主要是通過抑制ser16-PLN的磷酸化水平,調節肌漿網鈣調節蛋白SERCA2a的活性來影響心肌細胞內鈣的分布,從而影響心肌細胞靜息張力,導致心肌舒張功能障礙。

當然,我們的研究尚存在一些不足之處,例如D-半乳糖誘導的心肌細胞老化模型中可能除調節SERCA活性、抑制ser16-PLN的磷酸化水平之外還有其他作用機制有待進一步明確;此外,PLN存在3個磷酸化位點:Ser10(受PKC信號通路調節),Ser16(受PKA信號通路調節)和Thr17(受CaMKII信號通路調節),是否還可能通過CaMKⅡ或者PKC通路導老化致心肌舒張功能障礙有待進一步研究[16]。

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Mechanism of aging-associated diastolic dysfunction in cardiomyocytes induced by D-galactose via PKA pathway

LIUJing.

DepartmentofCardiology;

GUOYan.

DepartmentofGeriatrics;theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

Objective To investigate the mechanism of aging-associated diastolic dysfunction in cardiomyocytes induced by D-galactose. Methods Aging cardiomyocytes model was established by D-galactose after medication pretreatment. The cardiomyocytes were divided into four groups: normal group (group C), D-galactose group (D-G group), cAMP-dependent protein kniase A(PKA) pre-agonist group (D-G+cAMP group) and PKA pre-inhibit group (D-G+H-89 group). Cardiac sarcoplasmic reticulum calcium uptake ability of sarcoplasmic reticulum(SR), myocardial SERCA2a activity and Ser16phosphorylated phospholamban(Ser16-PLN)protein expression level were detected respectively. Results Compared with group C, increased diastolic [Ca2+]i, curtailment of the time from the maximum concentration of Ca2+to the baseline level and decreased reuptake of Ca2+stores in the SR were observed in D-G group and D-G+H-89 group. In addition, the levels of Ser16-PLN protein as well as SERCA2a activity were significantly decreased (P<0.05).Compared with D-G group, the levels of diastolic [Ca2+]iincreased, the time from the maximum concentration of Ca2+to the baseline level prolonged in D-G-89 group; The levels of diastolic[Ca2+]idecreased, the time from the maximum concentration of Ca2+to the baseline level shortened in D-G+cAMP group. After stimulated by caffeine, reuptake of Ca2+, the level of SERCA2a and Ser16-PLN deeereased in D-G-H-89 group and increased in D-G-cAMP group. Conclusions D-galactose can induce aging-associated diastolic dysfunction in cardiomyocytes through inhibiting PKA pathway, decreasing the amount of Ser16-PLN phosphorylation, and further inhibiting SERCA2a activity.

protein kinase A; Ser16-phosphorylated phospholamban; sarcoplasmic reticulum calcium ATPase; calcium homeostasis; cardiomyocyte aging

江蘇省衛生廳科技項目(Z201301)

210029江蘇省南京市，南京醫科大學第一附屬醫院心血管內科(劉靜)，老年醫學科(郭妍)

郭妍，Email：guoyan51@hotmail.com

R 737

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.02.007

2016-07-19)