注射用重組人白細胞介素-12用于治療惡性腫瘤的研究

王欽文，趙 毅，宮曉靜，于偉娜，楊麗榮，高 蕾，沈泓昱，萬玲琴，賈喜鳳，郭 娜，王義善

注射用重組人白細胞介素-12用于治療惡性腫瘤的研究

王欽文1，趙 毅2，宮曉靜3，于偉娜3，楊麗榮3，高 蕾3，沈泓昱3，萬玲琴3，賈喜鳳3，郭 娜3，王義善3

目的 探討注射用重組人白細胞介素-12(recombinant human interleukin-12,rhIL-12)同步干預腫瘤放射外科治療及晚期姑息治療患者，觀察用藥后對機體造血功能、全血細胞、免疫功能及輻射防護功能的影響。方法 53例接受射波刀治療的腫瘤患者，分別為150 ng/kg組19例，250 ng/kg組24例，對照組10例。47例接受晚期姑息治療的腫瘤患者，其中150 ng/kg組20例，250 ng/kg組21例，對照組6例，治療當天同步給藥，連續觀察4周，觀察治療的量效關系。結果 rhIL-12干預后兩組患者的造血功能、全血細胞、機體免疫調節、抗輻射損傷等均有改善趨勢。有19例首次給藥后發熱，9例周身不適，2例出現轉氨酶和膽紅素輕度升高，余無其他不良事件。結論 rhIL-12同步干預腫瘤放射外科、晚期腫瘤姑息治療，具有顯著的聯合增益作用，對造血功能抑制、機體免疫紊亂、輻射損傷防治具有較好的改善作用。

rhIL-12；放射外科；晚期腫瘤；防治研究

IL-12作為一種異源二聚體細胞因子，被認為是細胞免疫應答過程中的關鍵調節因子。IL-12能激活NK細胞、T細胞，并誘使其分泌大量γ-IFN，抑制腫瘤血管的生成，為其對多種腫瘤的防治提供依據[1]。RhIL-12與IL-12生物功能相似，是一種干細胞活化生長因子，作用于原始造血干細胞靜止期。因其純度高(≥98%)，活性強(≥10000 U/μg)，用量少(劑量多在可耐受的范圍)，且停藥后能迅速消退等優點，是目前國際唯一具有全面恢復造血功能、提高全血細胞數量、改善機體免疫功能、并具輻射損傷防治作用而且能輔助抗腫瘤的藥物。基礎實驗研究發現, rhIL-12可加快恢復機體造血功能,提高全血細胞數,促進全身免疫功能恢復,避免了某一血細胞快速升高而引起的高熱、栓塞、結膜出血、免疫反應等不良反應[2]。但目前對rhIL-12的研究報告均停留在基礎和動物實驗上，未能進入臨床推廣。本研究通過對腫瘤放射外科(射波刀、Cyber knife)及晚期腫瘤姑息治療患者應用該藥，探討用藥有效治療劑量及臨床不良反應，旨在為藥物研發和臨床應用提供科學依據。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2014-10至2015-09解放軍第107醫院全軍腫瘤無創診療中心/國家中西醫結合腫瘤治療重點專科，收住院需放射外科(Cyber knife)治療或晚期姑息治療的腫瘤患者116例。其中，男68例，女48例，年齡27～83歲，平均58.7歲。肺癌36例，肝癌34例，胰腺癌18例，乳腺癌12例，頭顱腫瘤10例，其他6例。可評價腫瘤復發轉移部位大小的實體瘤占85%(99例)，無法評價腫瘤大小的彌漫性浸潤性轉移占15%(17例)，腫瘤直徑為3～17 cm。術后復發或2個病灶以上占74%(86例)。

納入標準：(1)腫瘤經病理學、CT或MRI等影像學確診，根據國際衛生組織(WHO)臨床分期標準均為Ⅲ～Ⅳ期；(2)ECOG評分1～4分；(3)術后復發或淋巴神經細胞浸潤轉移，需接受放射外科治療、或晚期姑息治療的腫瘤患者；(4)納入患者均對研究檢測和治療知情同意。排除標準：(1)合并結核、心、肝、腎、肺等重要臟器功能嚴重衰竭者；(2)腫瘤確診為良性者；(3)有臟器移植或有過敏史者；(4)無妊娠、哺乳期婦女或計劃生育的育齡患者。

納入患者根據研究方案分為：(1)射波刀治療(Cyber knife)60例腫瘤患者，分別為150 ng/kg組22例，250 ng/kg組28例，對照組10例；(2)晚期姑息治療56例腫瘤患者，其中150 ng/kg組24例，250 ng/kg組26例，對照組6例。治療當天給藥，連續觀察4周,觀察骨髓造血功能(血象)、機體免疫，腫瘤評價指標(VEGF，IL-18，γ-IFN)及輻射損傷(SOD)等指標變化。

1.2 主要設備和藥品試劑 (1)設備：射波刀(Cyber knife)，型號第三代，美國Accuray公司生產；IGRT，型號EIektaSynergy,瑞典醫科達公司生產；全身用X線計算機體層攝影裝置，型號BrightSpeed Elite Select,美國GE公司產；流式細胞儀，美國BD公司生產；酶標儀，美國柏騰公司生產；化學發光儀、全自動生化分析儀，美國羅氏生產；血細胞分析儀，日本生產。(2)藥品：注射用重組人白細胞介素-12(CHO細胞)，青島康立泰藥業有限公司生產。(3)試劑：溶血素(美國R&D公司)；anti-human-IgG-FITC；anti-human-CD45-FITC、anti-human-CD56-PE、anti-human-CD3-PerCP-CD4-FITC-CD8-PE(美國BD公司)，Human/Total SOD2/Mn-SOD ELISA,Human/VEGF ELISA,Human/IFN-γ ELISA(美國R&D公司)。

1.3 方法 入院后，記錄三大常規、出凝血時間、心功能、腎功能、肝功能、影像學(CT、IMT、彩超)等檢查結果。本研究經醫院倫理委員會批準，對入選放射外科治療(Cyber knife、IGRT)的患者，簽署“精確放療”和“實驗研究”知情同意及《重組人白細胞介素-12對惡性腫瘤的臨床研究》協議書。采用16排CT行1.25 mm薄層掃描定位，必要時采用MRI、PET/CT等其他造影融合準確勾畫靶區，放射外科治療和晚期姑息治療兩個組腫瘤患者同步皮下注射rhIL-12干預，分為150 ng/kg和250 ng/kg兩個給藥組,并于給藥前、給藥后12 h、3 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d，各采集外周靜脈血，觀察對骨髓抑制、全血細胞趨勢(WBC、RBC、PLT等)變化；分析機體免疫、免疫調節趨勢(CD4/8、CD45、CD56)情況；探討抗氧化損傷、血清內細胞因子趨勢(SOD、VEGF、γ-IFN、IL-18)的綜合改善情況。

1.4 療效評價標準 (1)試驗檢測評價：對射波刀(Cyber knife)，大劑量短療程精確放療(可短時間內造成全血細胞減少，免疫功能下降的病例)和晚期姑息治療(對癥處理)患者兩個組，同步給予rhIL-12干預，期間觀察造血功能、機體免疫，腫瘤評價指標(VEGF，IL-18，γ-IFN)及輻射損傷(SOD)等指標變化趨勢。(2)客觀療效評價(WHO)：CR，所有癥狀體征完全消失4周；PR，腫瘤大小估計減少≥50%至少4周；NC，病變無明顯變化至少4周，腫瘤大小估計增大不到25%，減少不足50%；PD，出現新病灶，或原有病灶估計增大≥25%。(3)Zubrod-ECOG-WHO評分：0分，正常活動；1分，有輕度癥狀，但幾乎完全自由活動；2分，有時臥床，但白天臥床時間不超過50%；3分，需臥床，臥床時間白天超過50%；4分，臥床不起；5分，死亡。總有效率=(CR+PR)/總例數×100%。

1.5 統計學處理 采用SPSS13.0進行數據處理，采用二項分布檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 實驗研究共納入腫瘤放射外科、腫瘤晚期姑息治療患者116例，放射治療組有7例大劑量激素、脫水劑應用(150 ng/kg 3例，250 ng/kg 4例)未納入觀察標準；姑息治療組有9例試驗用藥1次后沒按要求返院(150 ng/kg 4例，250 ng/kg 5例)。全部進入試驗研究的有100例。

2.2 造血功能檢測 實驗研究檢查發現，rhIL-12干預后血細胞(WBC、PLT等)均存在短暫下降的現象，WBC尤為顯著，與用藥前相比有顯著性差異，繼續給藥均有改善趨勢。放射外科治療組：150 ng/kg劑量組3 d后逐漸回升，10 d達峰值，14 d后變化平緩，250 ng/kg劑量組12 h內降低顯著，3 d后逐漸回升，回升率低于150 ng/kg組，兩劑量比較未見明顯差異。姑息治療組100 ng/kg和200 ng/kg兩個劑量在3 d內降低，后期回升較為平緩。兩實驗組RBC均無顯著變化(圖1)。

2.3 機體免疫檢測 (1)放射外科治療組：用藥后兩劑量組CD4 /CD8比值有一過性下降，150 ng/kg劑量組在用藥后3 d回升，14 d達到峰值，仍低于用藥前水平，21 d后下降，CD45、CD56表達在14～21 d達峰值，恢復改善趨勢較明顯；250 ng/kg劑量組免疫指標在用藥后7 d回升,14～21 d維持高水平，仍低于用藥前水平，差異無統計學意義。(2)姑息治療組：趨勢與放射外科治療組相似，兩劑量組用藥后免疫指標均有下降，7 d后逐漸回升，回升率高于放射外科治療組，但差異無統計學意義，rhIL-12干預后機體免疫調節變化，結果顯示150 ng/kg劑量組CD4/CD8、CD45、CD56表達先降低后逐漸回升，14 d時出現峰值，機體免疫情況有所增強；其余各劑量組雖有回升，但顯效較低(圖2)。

2.4 細胞因子及輻射損傷檢測 (1)放射外科治療組：rhIL-12干預后，VEGF濃度在用藥后12 h稍有升高，后雖有不同程度下降，較用藥前無明顯意義；SOD在用藥后12 h升高，7～14 d維持高濃度水平，21 d后降低，仍高于用藥前水平，γ-IFN的濃度與藥物濃度呈正相關，用藥后γ-IFN均有不同程度升高，較用藥前有顯著性差異，IL-18與γ-IFN在免疫應答方面作為協同因子，表達趨勢大體相似。(2)姑息治療組：VEGF及SOD濃度在用藥后無統計學差異，較用藥前無明顯意義，IL-18與γ-IFN趨勢與放射外科組相似(圖3)。

2.5 客觀療效評價 放射外科治療組，兩劑量組緩解率(CR+PR)分別為84%、79%，與對照組(70%)相比，差異有統計學意義(χ2=8.099，P=0.017)。姑息治療組：兩劑量組緩解率分別為40%、42%，與對照組(33%)相比，差異有統計學意義(χ2=9.349，P=0.009)。放射外科治療組藥物干預4周內，rhIL-12通過提高患者免疫機能減少放療并發癥，在一定程度上改善或提高緩解率(表1)。

2.6 影像學評價 治療前后影像學變化，附放射外科聯合rhIL-12干預治療(肺癌、肝癌)2例，顯示患者治療后癥狀改善，病灶明顯縮小(圖4、5)。

圖1 rhIL-12應用于惡性腫瘤后造血功能檢測

圖2 rhIL-12應用于惡性腫瘤后免疫指標檢測結果

圖3 rhIL-12應用于惡性腫瘤后腫瘤評價指標及放射防護指標檢測結果

表1 rhIL-12應用于惡性腫瘤后不同劑量rhIL-12療效比較 (n；%)

圖4 rhIL-12應用于肺癌治療前后CT影像

A.肺癌治療前左肺門6.0 cm×5.0 cm×6.7 cm肺癌，包埋左肺動脈；B.肺癌治療后治療后50 d后，左肺門腫塊基本消失

圖5 rhIL-12應用于肝癌治療前后CT影像

A.肝癌治療前肝右葉5.0 cm×8.0 cm肝癌伴左葉轉移瘤，病灶明顯強化不均(靜脈期)；B.肝癌治療后45 d 右葉病灶縮小至4.4 cm×3.0 cm，左葉轉移瘤明顯縮小，無明顯強化(靜脈期)

3 討 論

體內的免疫細胞不僅維持著人體正常的生理平衡和穩定，同時也是抵抗腫瘤、殺傷腫瘤細胞的第一道防線。作為信息的傳遞員，其他的免疫調節因子或細胞因子共同參與免疫調節[3]。與此同時，腫瘤細胞通過各種機制應對或逃避免疫，腫瘤的生長過程可以被看作是機體免疫功能與腫瘤細胞此消彼長的一個動態過程。在腫瘤免疫功能研究中，發現了35種白介素，白介素是指在白細胞或免疫細胞間相互作用的淋巴因子，它和血細胞生長因子同屬細胞因子[4,5]，在以往的臨床實驗中，白介素多因某單一血象成份升高或藥物劑量純度問題引發臨床不良反應，因而尚未應用于臨床。

IL-12從發現至今已有30余年，作為一種多功能的細胞因子，是目前發現的最有效的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和自然殺傷細胞(NK)活性刺激因子，在炎性反應及抗腫瘤免疫中扮演著重要的角色[6]。RhIL-12直接或者間接通過骨髓微環境刺激其他細胞因子，對造血系統的輻射起到防護作用[2,7]。除此之外，靈長類動物的實驗證明，在完全沒有支持治療的情況下，接受致死劑量輻射后24 h給予微量rhIL-12可以顯著提高恒河猴的生存率[8]。而且rhIL-12能夠減少輻射后動物皮膚水分的流失及損傷面積，保留皮膚的樹突狀細胞，從而進一步促進皮膚傷口的愈合[9]。另外，rhIL-12具備其獨特之處，是目前發現的唯一能夠在輻射后24～48 h給藥仍然有效的制劑。以上說明IL-12具有明顯的輻射防護作用，它不僅提高亞致死或致死劑量照射動物存活率，還能促進受照動物造血功能全面恢復。

放射治療尤其是放射外科治療，在短時間內殺死、殺傷大量腫瘤細胞同時，也造成周圍正常組織放射性損傷，全血細胞減少，特別是白細胞、血小板迅速下降，造血功能抑制。另外，大劑量化療、多靶點放療，是造成并發癥的主要原因。由于以上原因，即使腫瘤病灶暫時消失，并不延長患者的生存期。IL-12作為抗腫瘤的輔助治療藥物已在國外多次進行Ⅰ和Ⅱ期臨床試驗[10-13]，發現皮下注射的給藥方式相對其他方式(腹腔及靜脈注射)更安全有效，不良反應(腹痛、疲勞、頭昏)發生率較低[13]。本研究在前期研究基礎上，使用rhIL-12干預放射外科手術治療及晚期姑息治療腫瘤患者，探討血象、免疫功能、腫瘤評價指標及抗輻射機能的變化趨勢。結果顯示，放射外科治療組在用藥后，全血細胞及免疫指標無大幅度下降趨勢，均在用藥后3 d回升,14～21 d維持高水平，SOD及γ-IFN均有升高趨勢，且γ-IFN的濃度與藥物濃度呈正相關，較用藥前差異有統計學意義，VEGF在用藥后無明顯趨勢。姑息治療組患者用藥后免疫機能有所提高，作為輔助用藥發揮協同性抗腫瘤效應，增強腫瘤殺傷作用，在一定程度上提高晚期腫瘤患者生活質量。

本研究中有19例首次用藥后發熱，9例周身不適，轉氨酶、膽紅素稍有增高改變各1例, 其他無自覺癥狀。不良反應隨用藥濃度的升高而增加，對癥治療后緩解。究其原因，可能與γ-IFN升高有關。有研究發現，rhIL-12的抗腫瘤作用與γ-IFN的表達正相關，但高表達γ-IFN帶來的毒性作用在一定程度上限制了rhIL-12的臨床應用[14,15]。另有研究報道， IL-12在正常小鼠體內抑制骨髓造血，而這種抑制作用與γ-IFN有關；在致死劑量照射的小鼠體內，IL-12卻有恢復造血功能的作用[16]。這提示IL-12在體內對造血起雙向調節作用，在造血功能正常機體內給予超過生理劑量的IL-12能夠抑制造血，而在造血受到輻射的機體內，IL-12能夠正向促進造血。患者皮下注射150 ng/kg，臨床指標均有回升趨勢，無明顯不良反應，因此筆者建議常規治療劑量為150 ng/kg。

綜上所述，rhIL-12有較好的促造血功能恢復、提高機體免疫力、增強抗輻射損傷及輔助腫瘤治療的作用，是目前臨床應用范圍廣、不良反應小、值得下一步開發推廣的新藥。

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(2016-10-26收稿 2016-11-15修回)

(責任編輯 郭 青)

Clinical effect of recombinant human interleukin-12 for injection on malignant tumor

WANG Wenqin1, ZHAO Yi2, GONG Xiaojing3, YU Weina3, YANG Lirong3, GAO Lei3, SHEN Hongyu3, WAN Lingqin3, JIA Xifeng3, GUO Na3，and WANG Yishan3.

1.Beijing Sanatorium for Retired Cadres, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100039, China; 2.Kang-tai Pharmaceutical Co., Ltd. Qingdao, Qingdao 266001, China; 3.Center of Non-traumatic Treatment and Diagnosis of Tumor, 107 Hospital of PLA, Yantai 264002, China

Objective To investigate the effect of rhIL-12 on the hemopoietic function, immune function, radiation protection function and tumor evaluation indexes in the tumor radiotherapy group and advanced palliative treatment group.Methods There were 53 cases of tumor patients treated with Cyber knife in treatment group, including 19 cases of 150 ng/kg, 24 cases of 250 ng/kg, and 10 cases of control. There were 47 cases of cancer patients in advanced palliative treatment group, including 20 cases of 150 ng/kg, 21 cases of 250 ng/kg, and 6 cases of control. rhIL-12 was given on the day of treatment and the therapeutic effect was observed for 4 consecutive weeks. The dose-effect relationship was studied.Results RhIL-12 could significantly inhibit the decline of blood cells, prevent immune disorders and reduce radiation injury in the two groups. After the first-dose, there were 19 cases of fever, 9 cases of discomfor, 2 cases of slight changes in serum aminotransferase and bilirubin. There was no other adverse event.Conclusions rhIL-12 may be a safe and effective drug for cancer prevention and treatment in clinical practice.

rhIL-12；radiosurgery；advanced tumor；research

吳階平醫學基金會重大專項(320.6750.14204)

王欽文,博士,主治醫師。

1.100039，軍事醫學科學院北京干休所;2.266001，山東省青島康立泰藥業有限公司；3.264002 煙臺，解放軍第107醫院全軍腫瘤無創治療中心

王義善，E-mail: wangyishan288@163.com

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