基于寡核苷酸鏈的汞離子熒光生物傳感器

劉晨光　王久軍　張興平　楊華林

摘要基于G四鏈體結構和卟啉類化合物N甲基卟啉二丙酸IX（NMM）結合產生強烈的熒光，利用THgT錯配對汞離子（Hg2+）的特異性識別，建立了一種簡單、靈敏、高效的Hg2+檢測新方法。在富含鳥嘌呤（G）寡核苷酸鏈中，引入了大量胸腺嘧啶（T）。在沒有Hg2+存在時，可以自發形成G四鏈體結構，與NMM結合產生強烈的熒光； 在Hg2+存在時，可與另一條富含T序列的互補鏈通過THgT特異性結合， 形成雙鏈DNA分子，從而導致G四鏈體結構不能產生。優化后最佳實驗條件為：緩沖溶液的pH=6.7， 20 mmol/L KCl， 2.5 μmol/L NMM， 反應時間為2 h。在優化條件下，體系的熒光強度變化值與Hg2+濃度呈現良好的線性關系，線性范圍為50～1000 nmol/L，檢出限為22.8 nmol/L（3σ）。此生物熒光傳感器對Hg2+具有良好的選擇性。實際水樣中Hg2+的加標回收率為106.1%～107.8%，可以滿足實際水樣品中Hg2+的檢測要求。

關鍵詞G四鏈體； THgT錯配； 汞離子； 熒光生物傳感器

1引 言

汞是一種常見的重金屬污染物，廣泛存在于水、空氣和土壤中[1]。可通過食物鏈在人體中富集，引起腦部、腎臟損傷和運動障礙等疾病，極大地威脅著人類健康[2，3]。因此，發展簡單、靈敏、快速檢測汞離子（Hg2+）濃度的方法具有重要意義。目前，常用的Hg2+檢測方法有原子吸收光譜法（AAS）[4]、原子熒光光譜法（AFS）[5]和電感耦合等離子體質譜法（ICPMS）[6]等，這些方法靈敏度和分辨率可以滿足實際檢測的需求，但是需要專業的操作人員和大型的儀器設備，不適合常規檢測。

G四鏈體結構是由富含鳥嘌呤的DNA中的4個鳥嘌呤通過氫鍵相互作用形成籠式結構[7～9]，可與卟啉類化合物N甲基卟啉二丙酸 IX（NMM）結合產生強烈的熒光[10]。與其它發光基團相比，G四鏈體/NMM復合物作為熒光報告基團，具有廉價、易于制備和儲存等優點，已用于檢測DNA[11，12]、RNA[13]、生物硫化物[14]和抗癌藥物[15]等。

Hg2+可以特異性地與胸腺嘧啶（T）結合，形成穩定的THgT配位化合物[16，17]。THgT的結合強度甚至超過了正常的TA配對的強度[18]。因此，THgT錯配可以作為一種良好的Hg2+識別元件。基于Hg2+通過THgT錯配可引起寡核苷酸鏈結構的變化、替換及重組的現象，研究者構建了許多Hg2+傳感器[19]，包括基于熒光基團的熒光傳感器[20，21]、基于石墨烯的電化學傳感器[22]及基于金納米粒子的比色傳感器[23]，其中有些方法可以實現Hg2+的可視化檢測[24]。然而，上述方法中，一般需要對相關材料進行化學修飾或者前處理，過程比較繁瑣。

本研究利用THgT特異性結合，基于G四聯體/NMM復合物的獨特熒光性質，建立了一種無需熒光標記、簡單、實用的Hg2+檢測方法。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

3結果與討論

3.1傳感器工作原理及可行性分析

Hg2+傳感器原理如圖1所示。設計了兩條寡核苷酸鏈P1和P2，P1為富G序列，可以自發形成G四鏈體結構。 同時，在P1的多聚鳥嘌呤序列中間引入了大量胸腺嘧啶。P2為富含胸腺嘧啶的P1不完全互補鏈，在Hg2+存在時，可以通過THgT錯配，形成雙鏈DNA分子。在無Hg2+存在時，P1自發形成G四鏈體結構，與反應體系中的NMM結合，產生強烈的熒光。當Hg2+存在時，P1和P2通過THgT特異性結合形成雙鏈DNA分子，阻止G四鏈體產生，使得體系熒光信號下降，從而實現對Hg2+的檢測。

為了驗證方法的可行性，測定了不同條件下的熒光光譜，結果如圖2所示。當NMM單獨存在時，背景信號比較微弱（圖2a）。當僅加入P1和P2時，P1不能與P2互補配對形成雙鏈DNA，P1自身形成G四鏈體結構，與NMM結合產生強烈熒光（圖2d）。而當Hg2+存在時， P1和P2通過THgT錯配形成穩定的DNA雙鏈，導致P1的G四鏈體結構不能形成，從而造成熒光強度明顯下降（圖2c）。實驗結果表明，基于上述原理可以實現對Hg2+的檢測。

0.2 mol/L Na2HPO4NaH2PO4緩沖液（pH = 6.1）中，加入不同濃度的KCl，室溫反應0.5 h，測量熒光信號變化。如圖3A所示，在0～10 mmol/L濃度范圍內，隨著KCl濃度增加，熒光信號大幅提高； 之后熒光強度增長緩慢，KCl濃度為20 mmol/L時，熒光信號達到最大值； 繼續增加KCl濃度，熒光信號強度幾乎不變。因此，后續實驗采用20 mmol/L KCl。

3.2.2NMM濃度的優化由反應原理可知，NMM濃度過低，不能完全結合形成的G四鏈體結構，造成測定結果不準確； 但是由于NMM自身帶微弱的熒光，濃度過大又會產生較大的背景信號，因此需對NMM的用量進行優化。考察不同濃度的NMM的影響，測量熒光信號和本底信號差值的變化F-FNMM（F為加入NMM后的熒光值，FNMM為不加P1時的本底熒光值）。如圖3B所示，隨著NMM濃度的升高，熒光信號不斷增強。當NMM濃度為2.5 μmol/L時，體系的熒光值達到最大。再增加NMM用量，背景信號增強，而體系熒光強度不再增加，造成熒光信號和本底信號差值減小。因此，NMM最佳濃度為2.5 μmol/L。

3.2.3pH值的優化進一步考察了所用Na2HPO4NaH2PO4緩沖液的pH值對測量結果的影響。結果如圖3C所示， F0為不加Hg2+的體系的熒光強度， F為加Hg2+后的熒光強度，當pH=6.7時，加入Hg2+前后的熒光變化值（F0-F）達到最大值。因此，本研究選擇pH 6.7的磷酸鹽緩沖體系。

3.2.4Hg2+反應時間的優化Hg2+存在時，通過THgT特異性結合使P1和P2形成雙鏈DNA分子。對此反應時間進行了優化。在125 nmol/L P1、125 nmol/L P2、0.2 mol/L Na2HPO4NaH2PO4緩沖液（pH 6.7）中加入600 μmol/L Hg2+，室溫反應不同時間，然后加入20 mmol/L KCl和2.5 μmol/L NMM，室溫反應0.5 h，測量熒光信號變化情況。如圖3D所示，隨著反應時間延長，熒光信號逐漸下降，反應2 h后，熒光信號趨于穩定，說明此時Hg2+與胸腺嘧啶反應完全。因此，本實驗選用2 h作為反應時間。

AbstractA simple， fast and highly sensitive fluorescence analysis method for detection of mercury ion was developed based on Nmethylmesoporphyrin IX（NMM）/Gquadruplex DNA system and specific THgT mismatches. In this strategy， a large number of thymine was introduced into guaninerich oigonucleotides which could form Gquadruplex. In the presence of Hg2+， guaninerich oigonucleotides and complementary strand could form doublestranded DNA molecule by specific THgT mismatch pair， leading to destruction of Gquadruplex DNA structure. In the absence of Hg2+， guaninerich oigonucleotides spontaneously formed Gquadruplex DNA structure that could bound NMM to generate intense fluorescence. Based on the above facts， a sensitive fluorescence biosensor for determination of Hg2+ was fabricated. And the optimal conditions for Hg2+ determination were as follows： buffer solution pH of 6.7， 20 mmol/L KCl and 2.5 μmol/L NMM in buffer and incubation for 2 h. Under the optimal conditions， the fluorescence intensity signal change （F0-F） and the Hg2+ concentration exhibited a linear correlation within 50 nmol/L to 1000 nmol/L range with a low detection limit of 22.8 nmol/L （3σ）. The biosensor exhibited good selectivity toward common metal ions. The developed method was successfully employed to detect Hg2+ in tap water with recovery of 106.1%-107.8%.

KeywordsGQuadruplex deoxyribonucleic acid； ThymineHgthymine mismatches； Mercury ion； Fluorescence Biosensor