超高壓液相色譜串聯高分辨質譜篩查漁用投入品中禁限用藥物

孔聰　周哲　汪洋　黃原飛　沈曉盛　黃冬梅　蔡友瓊　于慧娟

摘要建立了超高壓液相色譜靜電場軌道離子阱質譜系統對漁用投入品中可能造成風險隱患的禁限用藥物的快速篩查與定量技術。以水（含1%甲酸）乙腈（1∶9， V/V）溶液進行提取，通過稀釋降低基質效應，在Accucore RPMS 色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm）上，以水（含0.1%甲酸）和乙腈（含0.1%甲酸）溶液為流動相，利用梯度洗脫、ESI離子化，Fullscan ddMS2 （opN）掃描模式進行數據采集，通過與預先建立好的藥物標準品質譜、色譜數據庫進行比對分析，實現了53種禁限用藥同時篩查確證與定量分析。各藥物最低檢出濃度均低于10 ng/mL，在0.01～1.0 μg/mL范圍內，各藥物的線性相關系數均大于0.98，根據實際測定結果設定對漁藥及漁用飼料中篩查藥物的檢出限分別為0.5和5.0 mg/L，對漁藥及漁用飼料基質添加10和100 mg/kg 的各篩查成分，定量回收率均高于50%，相對標準偏差均小于15%。將本方法用于農業部漁用投入品質量安全隱患排查項目中，共篩查68個樣品，其中在29個漁用獸藥樣品中篩查出15種說明書中未標明成分。

關鍵詞漁用投入品； 篩查； 高分辨質譜

1引 言

我國水產養殖產量占全世界總量70%左右，是漁用投入品（包括漁藥與漁用飼料）生產與消費大國[1]。漁用投入品中添加違禁藥物將導致水體污染、水產品違禁藥物殘留，并通過食物鏈富集轉移到人體中，危害人體健康[2]。在我國，存在漁用投入品中添加禁用或限用藥物的不規范生產和使用現象，導致其在水產品中殘留超標，影響我國養殖水產品質量安全，有必要對漁用投入品中禁限用藥物進行檢測，以確保投入品的安全使用[3]。

目前，漁用投入品中禁限用藥物的檢測主要采用液相色譜法[4]、液相色譜串聯質譜法[5]、氣相色譜串聯質譜法[6]、酶聯免疫吸附分析法[7]等。液相色譜三重四極桿質譜聯用技術具有檢出限低、準確度高和重現性好等特點，在漁用投入品檢測中應用最為普遍[8]。但由于漁用投入品理化性質差別較大，且三重四極桿質譜儀質量精密度較低，單次檢測較多種類的化合物相互干擾較大，通常以結構類似的同族藥物或單一藥物來開發相應的方法[9]，在藥物篩查中需建立多種檢測方法，且對非檢項目的篩查能力不足，造成檢測資源浪費， 通過高效的多組分同時篩查和定性技術可解決該問題[10，11]。

基于靜電場軌道離子阱的超高分辨率質譜技術為多組分目標化合物分析提供了新的研究方向[12]。靜電場軌道離子阱質譜系統與色譜分離技術串聯，可在一次檢測過程中對數百種化合物進行分析[13]。該質譜可進行基于母離子強度猝發的子離子掃描模式，可實現母離子全掃描模式下對目標化合物進行選擇性子離子掃描，同時實現篩查與確證功能[14，15]。

根據歷年中國農業部辦公廳漁用投入品質量安全隱患排查計劃，本研究針對漁用投入品中可能造成的風險隱患的各種禁限用藥物成分，利用超高壓液相色譜靜電場軌道離子阱質譜系統，對禁限用藥物標準品在統一的參數下進行分析，建立藥物色譜質譜信息庫，開發禁限用藥物篩查與定性確證方法，成功用于對漁用投入品的隱患排查，為我國漁用投入品安全隱患的有效監控提供了新技術。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Ultimate 3000超高壓液相色譜QExactive靜電場軌道離子阱質譜聯用系統（附帶Xcalibur及racefinder操作與分析軟件，美國hermo Fisher 公司）； NEVAP 112氮吹濃縮儀（美國Organomation公司）； 渦旋攪拌器（德國IKA VOEX X3）； CL6R離心機（湘儀離心機儀器有限公司）； 16RXII高速冷凍離心機（日本IACI CF公司）； MilliQ超純水機（美國Millipore公司）； PL602L電子天平（Mettleroledo公司）； B 125D精密天平（Sartorius公司）； KQ300E超聲波提取儀（ 昆山市超聲儀器有限公司）。hermo Accucore RPMS色譜分離柱（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm， 美國hermo公司）。

53種風險排查物質標準品（見表1）均購于Dr.Ehrenstofer Gmb公司。乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、二氯甲烷（色譜純，Fisher Scientific公司）； 二甲基亞砜、冰醋酸、乙二胺四乙酸二鈉 （分析純，國藥集團化學試劑有限公司）； 乙酸銨（PLC 級，Fluka公司）； 甲酸（ACS純，美國Sigma公司）； 實驗用水為超純水。

2.2實驗方法

2.2.1溶液配制稱取各藥物標準品5 mg左右，以甲醇溶解并定容至50 mL，不易溶解藥品可先加入1 mL甲酸或二甲基亞砜溶解，繼續配制成100 μg/mL 左右的單標儲備液，

2.2.2樣品提取方法漁藥： 準確稱取各漁藥500 mg（液體藥品以移液槍量取500 μL），以乙腈（含1%甲酸） 25 mL充分溶解， 8000 r/min離心30 min，取上清液待用。

漁用飼料： 將漁用飼料充分混勻均質，稱取樣品（5.00 ± 0.05）g于50 mL離心管中，加入0.1 g 乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDA）以及水乙腈溶液（1∶9， V/V， 含1%甲酸）提取劑25 mL， 混合，常溫渦旋振蕩提取5 min，超聲溶解20 min， 8000 r/min離心30 min，取上清液待用。

2.2.3色譜分析條件Accucore RPMS色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm）； 流速： 0.3 mL/min； 柱溫： 30℃； 進樣量： 20 μL； 流動相A為水（含0.1%甲酸），流動相B為乙腈（含0.1%甲酸）； 洗脫梯度： 0～3.0 min，5% B； 3.0～22.0 min，5%～100% B； 22.0～25.0 min，100% B； 25.0～25.1 min，100%～5% B； 25.1～30.0 min，5% B。

2.2.4質譜分析條件ESI離子源，噴霧電壓： 3200 V（+），2800 V（-）； 鞘氣： 40 arb； 輔氣： 10 arb； 吹掃氣： 1 arb； 氣體加熱溫度： 350℃； 離子傳輸管溫度： 325℃； 質譜數據獲取模式： Fullscan ddMS2 （opN） 掃描模式。

2.2.5定性篩查信息庫、篩查確證、定量方法收集整理各篩查藥物分子式，以獲知其分子量、分子離子峰、質荷比等信息，在優化的色譜和質譜檢測條件下，獲得以100 ng/mL藥物標準品的色譜保留時間與母離子和子離子信息，在racefinder中創建各藥物的篩查比對信息庫。對處理好的待篩查樣品采用Fullscan ddMS2 （opN）質譜采集方法上機分析，通過已建立好的各藥物質譜數據信息庫對待篩查樣品的數據進行比對篩查、確證。以同樣的方法對10，50，100，500和1000 ng/mL濃度的混合標準工作液進行分析，通過racefinder對定性篩查出的陽性藥物選擇母離子進行定量分析。

3結果與討論

3.1實驗條件的優化

3.1.1提取劑的選擇漁藥屬于純度較高的藥品，雜質較少，采用合適的溶劑直接溶解即可獲得較高的提取效率。而對于漁用飼料，考慮采用混合提取劑進行其中藥物的提取。由于磺胺類、喹諾酮類在酸性條件下更容易被溶解提取，五氯酚鈉在酸性條件下變為五氯酚，從而可溶于有機溶劑，其它藥物（孔雀石綠、結晶紫、硝基呋喃類、喹乙醇、己烯雌酚、阿維菌素類、氯霉素類等）易溶于乙腈及其酸性溶液中，而三唑磷在酸堿介質中易水解，故提取劑酸度不宜過高，因而采用水乙腈溶液（1∶9， V/V， 1%甲酸）。而四環素在純乙腈及酸化乙腈中的提取效率均較低，參考相關研究，加入提取液前加入Na2EDA可將四環素的提取效率提高至60%，同時保證其它藥物的提取效率在70%以上[16]。

3.1.2凈化條件的優化將提取液以水（含0.1%甲酸）稀釋10倍后，分別在LB、中性氧化鋁和C18固相萃取柱上負載、洗脫收集及溶解分析，3種小柱對大部分化合物的回收率均不理想，多低于40%，特別是四環素類、五氯酚鈉及部分磺胺類等強極性藥物極易丟失，回收率低于10%。采用直接稀釋基質方法進行凈化，對于乳液制劑及有較多固體基質溶解的藥品和漁用飼料，取其提取液100 μL用900 μL水乙腈溶液（5∶95， V/V， 含0.1%甲酸）稀釋，各雜質成分濃度降低90%，基質效應干擾大大降低，保證了各藥物的回收率均大于50%。對于部分純度較高、基本無基質溶出的漁藥，直接以1 mL提取劑提取，直接用流動相稀釋檢測對篩查和定量分析并不產生影響。

3.1.3液相色譜條件的優化采用雙流動相條件下梯度洗脫模式，考察了在不同酸堿度以及緩沖鹽存在條件下各藥物分離及離子化效率。以純水為水相，甲醇或乙腈為有機相， 可在25 min內洗脫所有目標物，但乙腈對四環素類、磺胺類的色譜分離后信號響應和峰形均較好。甲酸的加入可明顯提高硝基呋喃類、孔雀石綠、結晶紫、磺胺類、喹諾酮類和四環素的正離子化效率，但部分降低了氯霉素類以及五氯酚鈉的負離子化效率。本研究最終采用水（含0.1%甲酸）與乙腈（含0.1%甲酸）作為流動相，在0～25 min 內依次按極性由強到弱洗脫各化合物，目標物的峰形較好，并保持了較高的檢測靈敏度。

3.1.4質譜條件的優化本研究采用Full Scan /ddMS2（opN）質譜掃描模式采集數據，可連續對洗脫化合物進行全譜掃描，當母離子的信號強度超過設定閾值時，選取單次掃描最強的若干母離子進行子離子掃描，所獲得的均為高分辨數據，在篩查與確證過程中具有很強的可信度。采用以上掃描模式獲取的數據對藥物進行篩查與確證后，同時以母離子進行定量分析，實現了對藥物的準確篩查定性和定量，部分藥物的提取離子流圖如圖1所示。

3.2藥物篩查信息庫建立

各藥物的篩查比對信息如表1所示，部分化合物為同分異構體，且在質譜中第一、第二強的子離子信號相同，但其保留時間不同， 故可進行有效區分。

3.3基質效應

基質效應的評價通過如下公式計算： 基質效應=（1-基質空白溶液加標信號強度/空白溶劑加標信號強度）×100%。漁藥和漁用飼料提取液在前處理過程中通過溶劑稀釋，將基質濃度降低了10倍，其在實際檢測過程中基本不受基質效應影響，結果表明，所有待篩查藥物的基質效應均小于15%，屬于低基質效應影響，故在實際定量分析過程中省略基質加標曲線分析過程。

3.4篩查與確證

對藥物標準品與空白加標樣品進行分析比對時，各類信息重復性和穩定性由優到差依次為： 母離子質量數、保留時間、子離子中最強的兩個離子質量數及豐度比、子離子其它離子信息。本研究根據比對信息的穩定性，在對樣品的篩查過程中，依次需要滿足以上前3個條件，方可確定樣品中陽性組分的存在。通過Xcalibur獲取數據，并通過racefinder編輯藥物的比對信息，按照確定的比對標準進行篩查確證與定量分析，最終實現了對實際漁用投入品的各藥物的定性篩查與定量分析。

3.5方法學考察

對配制的1～10 ng/mL各標準品進行檢測，通過篩查數據庫進行定性篩查確證，結果表明，隱色結晶紫、伊維菌素在10 ng/mL水平下均可檢出； 呋喃妥因、呋喃西林、噁喹酸、氟甲喹、培氟沙星、土霉素、金霉素、阿維菌素在5 ng/mL下均可檢出； 其它藥物均可在1 ng/mL水平下檢出。針對漁用投入品中禁限用藥物的篩查可基于較高檢出限條件下進行，即使添加藥物含量為5 mg/kg，經過前處理過程后均超過以上檢出限，完全可滿足實際篩查需要。在檢測濃度范圍內，各藥物標準品保持了良好的線性關系，線性相關系數均大于0.98，保證了漁用投入品的篩查與定量結果準確性。

對不同的漁用飼料及漁藥基質分別添加濃度為10 和100 mg/kg的混合藥物，篩查與定量結果表明，各藥物的檢出率為100%，在漁藥基質中各藥物的回收率>90%，相對標準偏差<5%； 而在各飼料基質中，各藥物的回收率>50%，兩個加標水平的每種藥物的定量結果的相對標準偏差均小于15%（表2）， 表明本篩查方法的定量分析結果具有很好的準確性和精密度。

3.6實際樣品分析

將本方法應用于華東地區的漁用投入品質量安全隱患排查項目中68個樣品的分析，采用建立的藥物篩查數據庫進行53種化合物的分析，對于飼料樣品通過基質空白加標進行回收率校正，對于漁藥樣品直接進行定量分析。在29個漁用獸藥樣品中，檢出15種在說明書中未明確標明的篩查藥物，且檢出含量均超過100 mg/L，結果如表3所示。

4結 論

本研究針對漁用投入品中可造成風險隱患的禁限用藥物成分在投入品中高含量特點，通過簡單的提取與稀釋凈化方法，利用超高壓液相色譜串聯靜電場軌道離子阱質譜系統，對禁限用藥物在統一的參數下進行分析，建立藥物色譜質譜數據庫，開發禁限用藥物同時篩查、定性確證與定量方法，成功應用于漁用投入品中禁限用的藥品的隱患排查。

Abstracto screen the illegal substances in fishery inputs， we established the database including the precursor and the daughter ions for these possible components by the quadrupole/orbittrap mass spectrometer， and the retention time of each drug on the same chromatographic column. And then， the extracted and diluted samples were analyzed and the components in the real samples were identified under the same conditions. Chromatographic analysis was performed on an Accucore RPMS column （100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm） using gradient elution with 0.1% formic acid in water and 0.1% formic acid in acetonitrile as mobile phase. Elutes were ionized through heatable electrospray ionization （ESI） in both positive and negative mode simultaneously. Data acquisition was conducted by Fullscan ddMS2 （opN） mode， in which the full mass profile for a continuous precursor ion injection and the fragments of each high abundant precursor of targeted were acquired with excellent time and mass resolution. Screening was carried out through comparison of the information of real samples with that of standards in the database， which were processed by software （racefinder）. he Quantification of each component was analyzed based on the precursor ion chromatography acquired by orbittrap mass spectroscopy， which showed a good linearity between 0.01-1 μg/mL， with R>0.98. he method was validated by checking its minimum screening concentration （0.5 mg/L for drugs and 5 mg/L for feedstuffs） and evaluating the recovery after addition of the standard mixture in real samples （>50%， under the addition of 10 and 100 mg/kg）. he results for 68 practical samples demonstrated the effective performance of this method for screening with highthroughput， rapidness and acceptable minimum screening concentration and accuracy， in which 15 of 29 fishery drug samples were screened out for positive components that were not indicated in their labels.

KeywordsFishery drug； Screen； igh resolution mass spectroscopy