HPLC法同時測定杜仲補天素片中6種成分的含量Δ

李云靜，何忠梅（1.吉林工程職業學院生物工程學院，吉林四平 136001；2.吉林農業大學中藥材學院，長春 130117）

HPLC法同時測定杜仲補天素片中6種成分的含量Δ

李云靜1＊，何忠梅2#（1.吉林工程職業學院生物工程學院，吉林四平 136001；2.吉林農業大學中藥材學院，長春 130117）

目的：建立同時測定杜仲補天素片中麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18，流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測波長為330 nm（麥角甾苷和吉奧諾苷B1）、210 nm（去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸），柱溫為35℃，進樣量為10 μL。結果：麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸檢測質量濃度線性范圍分別為～74.20 μg/mL（r＝0.999 9）、4.35～87.00 μg/mL（r＝0.999 5）、3.86～77.20 μg/mL（r＝0.999 9）、5.05～101.00 μg/mL（r＝0.999 1）、4.20～84.00 μg/mL（r＝0.999 7）、4.73～87.40 μg/mL（r＝0.999 6）；定量限分別為0.322、0.187、0.105、0.381、0.214、0.452 μg/mL，檢測限分別為0.108、0.059、0.032、0.131、0.072、0.149 μg/mL；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.20%～99.53%（RSD＝1.23%，n＝6）、96.99%～100.67%（RSD＝1.47%，n＝6）、96.64%～100.08%（RSD＝1.28%，n＝6）、97.47%～100.59%（RSD＝1.18%，n＝6）、97.97%～100.83%（RSD＝1.25%，n＝6）、96.81%～99.61%（RSD＝1.09%，n＝6）。結論：該方法操作簡便、快速、準確，可用于杜仲補天素片中麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的同時測定。

高效液相色譜法；杜仲補天素片；麥角甾苷；吉奧諾苷B1；去氫土莫酸；豬苓酸C；去氫茯苓酸；茯苓酸；含量測定

杜仲補天素片由熟地黃、茯苓、杜仲（鹽水炒）、菟絲子（制）、肉蓯蓉等25味中藥材組成，具有補氣益血、溫腎養心、壯腰安神的功效，主要用于腰膝酸軟、夜多小便、神經衰弱等癥的治療。該制劑收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》（第12冊）[1]。現行標準僅規定了性狀鑒別及制劑通則的檢查項[1-2]，未對該制劑處方中的任何藥物所含成分進行定量測定；現有相關文獻[3-7]也僅對其單一藥材及含該藥材的其他制劑的含量進行測定。為了更好地控制該制劑的質量，筆者以熟地黃[4]中所含麥角甾苷和吉奧諾苷B1與茯苓[4]中所含去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸為指標成分，采用高效液相色譜法（HPLC），以梯度洗脫的方式同時測定上述6種成分的含量，以期為完善杜仲補天素片質量標準提供依據。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括自動進樣器、Empower Pro色譜工作站、G1315B可變波長檢測器（美國Waters公司）；Tu-1901型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；BT25S型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；KQ-100DB型數控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：100 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

杜仲補天素片（貴州漢方藥業有限公司，批號：1502114、1503108、1504123，規格：0.27 g/片）；麥角甾苷對照品（批號：22323-52-0，純度：98.0%）、茯苓酸對照品（批號：29070-92-6，純度：98.0%）均購于成都曼思特生物科技有限公司；吉奧諾苷B1對照品（批號：120406-37-3，純度：98.0%）、去氫土莫酸對照品（批號：6754-16-1，純度：99.0%）均購于成都普瑞法科技開發有限公司；豬苓酸C對照品（批號：465-18-9，純度：98.0%）、去氫茯苓酸對照品（批號：77012-31-8，純度：98.0%）均購于南京森貝伽生物科技有限公司；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

熟地黃、茯苓、杜仲、菟絲子、肉蓯蓉、遠志、當歸、蓮子、澤瀉、牡丹皮、白芍、淫羊藿、黃芪、山藥、白術、陳皮、砂仁、女貞子、金櫻子、山茱萸、巴戟天、柏子仁、黨參、枸杞子、甘草等藥材均購于吉林省北藥藥材加工有限公司，經吉林農業大學中藥材學院何忠梅副教授鑒定為真品，同時按照2015年版《中國藥典》（一部）相關標準[3]檢驗均符合質量標準規定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～11 min，21.0%A；11～27 min，21.0%→34.0%A；27～48 min，34.0%→65.0%A；48～56 min，65.0→21.0%A）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：330 nm[3，5]（0～27 min，麥角甾苷和吉奧諾苷B1）、210 nm[6]（27～56 min，去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸）；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取麥角甾苷對照品7.42 mg、吉奧諾苷B1對照品8.70 mg、去氫土莫酸對照品7.72 mg、豬苓酸C對照品10.10 mg、去氫茯苓酸對照品8.40 mg和茯苓酸對照品8.74 mg，分別置于不同的10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得各待測成分的單一對照品貯備液。再分別取麥角甾苷對照品貯備液5.0 mL、吉奧諾苷B1對照品貯備液2.0 mL、去氫土莫酸對照品貯備液2.5 mL、豬苓酸C對照品貯備液1.0 mL、去氫茯苓酸對照品貯備液1.5 mL和茯苓酸對照品貯備液5.0 mL，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，除去包衣層，研成細粉，精密稱取4.0 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理60 min，放冷；再次稱定質量，加甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和配方比例，分別制備缺熟地黃和茯苓的單一陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備單一陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞2.0；理論板數分別以麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸、茯苓酸峰計均≥3 000，保留時間分別為16.6、21.5、32.6、34.8、37.6、43.1 min。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于20 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equation and linear ranges

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得定量限（LOQ）；當信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD）。結果，麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸的LOQ分別為0.322、0.187、0.105、0.381、0.214、0.452μg/mL；LOD分別為0.108、0.059、0.032、0.131、0.072、0.149μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復進樣測定6次，記錄峰面積。結果，麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸峰面積的RSD分別為1.02%、0.99%、1.10%、1.17%、0.93%、0.86%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：1502114）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸峰面積的RSD分別為0.83%、0.95%、1.02%、1.07%、0.99%、0.88%（n＝5），表明供試品溶液在室溫放置12 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：1502114）6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸平均含量分別為0.483、0.211、0.227、0.116、0.160、0.571 mg/g，RSD分別為1.08%、1.06%、0.96%、1.01%、1.12%、0.97%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：1502114）適量，共6份，每份約2.0 g，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，再加入一定質量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（s，n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（s，n＝3，mg/g）

表3 樣品含量測定結果（s，n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（s，n＝3，mg/g）

樣品批號1502114 1503108 1504123麥角甾苷0.482±0.005 0.475±0.002 0.488±0.004吉奧諾苷B10.211±0.002 0.205±0.001 0.216±0.003去氫土莫酸0.224±0.003 0.229±0.002 0.218±0.002豬苓酸C 0.117±0.002 0.121±0.001 0.111±0.002去氫茯苓酸0.159±0.001 0.164±0.002 0.153±0.001茯苓酸0.571±0.004 0.587±0.007 0.565±0.005

3 討論

3.1 提取時間的選擇

以待測成分的提取率為指標，對不同超聲提取時間（30、60、90 min）進行對比試驗，結果超聲提取60 min和90 min，所測各成分提取效果差異不大，但都明顯高于超聲提取30 min所測各成分含量，為了節約試驗時間，故本試驗選取60 min作為超聲提取的最佳時間。

3.2 檢測波長的選擇

取“2.2.1”項下單一對照品貯備液各適量，在190～400 nm波長范圍內進行紫外掃描。結果表明，麥角甾苷和吉奧諾苷B1在330 nm波長處有最大吸收，去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸在210 nm波長處有最大吸收，故麥角甾苷和吉奧諾苷B1檢測波長定為330 nm，去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸檢測波長定為210 nm。

3.3 流動相的選擇

筆者在試驗過程中分別采取乙腈-0.05%磷酸溶液[7-8]、乙腈-0.1%乙酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液[9]、乙腈-0.2%磷酸溶液[10]以不同比例進行梯度洗脫，以待測成分的出峰時間、峰形和分離度效果為評價指標進行綜合評價，優選最佳的檢測流動相體系。結果，乙腈-0.05%磷酸溶液按不同比例進行梯度洗脫時，麥角甾苷和吉奧諾苷B1分離效果較好，但去氫土莫酸和豬苓酸C達不到有效分離；乙腈-0.1%乙酸溶液按不同比例進行梯度洗脫時，去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸能有效分離，但麥角甾苷峰形較差，拖尾現象嚴重；以乙腈-0.2%甲酸溶液按不同比例進行梯度洗脫時，去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸分離度均能達到要求，但吉奧諾苷B1與其他雜質峰達不到有效分離；乙腈-0.2%磷酸溶液按照“2.1”項下比例進行梯度洗脫時，各待測成分色譜峰的出峰時間、峰形和分離度效果較好，故選擇乙腈-0.2%磷酸溶液為本試驗的流動相。

3.4 耐用性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：1502114）適量，分別采用 Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Kromasil C18（200 mm×4.6 mm，5μm）和 Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）進行對比研究。結果，采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）進行試驗時，所測成分吉奧諾苷B1與其他峰分離效果較差；采用Kromasil C18（200 mm×4.6 mm，5μm）進行試驗時，所測成分去氫土莫酸和豬苓酸C達不到有效分離；采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）進行試驗時，所測成分均能達到有效分離，故最終采用kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）進行試驗。

綜上所述，本方法操作簡便、快速、準確，可用于杜仲補天素片中麥角甾苷、吉奧諾苷B1、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 6 Components in Duzhong Butiansu Tablet by HPLC

LI Yunjing1，HE Zhongmei2（1.College of Bioengineering，Jilin Engineering Vocational College，Jilin Siping 136001，China；2.College of Traditional Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130117，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of acteoside，jionoside B1，dehydrotumulosic acid，polyporenic acid C，dehydropachymic acid and pachymic acid in Duzhong butiansu tablet.METHODS：HPLC was performed on the column of Kromasil C18with mobile phase of acetonitrile-0.2%phosphate acid（gradient elution）at a flow rate of 0.8 mL/min，the detection wavelength was 330 nm for acteoside and jionoside B1，210 nm for dehydrotumulosic acid，polyporenic acid C，dehydropachymic acid and pachymic acid，the column temperature was 35℃，and the injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range was 3.71-74.20 μg/mL for acteoside（r＝0.999 9），4.35-87.00 μg/mL for jionoside B1（r＝0.999 5），3.86-77.20 μg/mL for dehydrotumulosic acid（r＝0.999 9），5.05-101.00 μg/mL for polyporenic acid C（r＝0.999 1）and 4.20-84.00 μg/ mL for dehydropachymic acid（r＝0.999 7）and 4.73-87.40 μg/mL for pachymic acid（r＝0.999 6）；the limits of qu-antification were 0.322，0.187，0.105，0.381，0.214，0.452 μg/mL，and the limits of detection were 0.108，0.059，0.032，0.131，0.072，0.149 μg/mL；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 96.20%-99.53%（RSD＝1.23%，n＝6），96.99%-100.67%（RSD＝1.47%，n＝6），96.64%-100.08%（RSD＝1.28%，n＝6），97.47%-100.59%（RSD＝1.18%，n＝6），97.97%-100.83%（RSD＝1.25%，n＝6）and 96.81%-99.61%（RSD＝1.09%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，accurate，and can be used for the simultaneous determination of acteoside，jionoside B1，dehydrotumulosic acid，polyporenic acid C，dehydropachymic acid and pachymic acid in Duzhong butiansu tablet.

HPLC；Duzhong butiansu tablet；Acteoside；Jionoside B1；Dehydrotumulosic acid；Polyporenic acid C；Dehydropachymic acid；Pachymic acid；Content determination

R917

A

1001-0408（2017）03-0401-04

2016-01-30

2016-10-09）

（編輯：劉 柳）

吉林省科技發展計劃項目（No.20140311029YY）

＊副教授，碩士。研究方向：生物制藥、發酵技術、藥用酶生產與教學工作。E-mail：523882748@qq.com

#通信作者：副教授，碩士生導師，博士。研究方法：中藥有效成分作用機制及產品開發。E-mail：hezhongmei1978@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.32