多重PCR技術在雞病毒性傳染病診斷中的應用研究進展

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（1.新鄉縣小冀鎮人民政府便民服務中心，河南 新鄉 453003；2.河南科技學院）

多重PCR技術在雞病毒性傳染病診斷中的應用研究進展

姬中鋒1，李夢麗2，葛亞明2*，趙樸2*

（1.新鄉縣小冀鎮人民政府便民服務中心，河南 新鄉 453003；2.河南科技學院）

多重PCR（multiplex PCR，mPCR），是由普通PCR延伸而來的一項PCR技術，在同一PCR反應體系里加入兩對或兩對以上引物，同時擴增出多個目的核酸片段的PCR反應。因其可在單一PCR體系中，同時擴增多個目的片段，多重PCR不僅保留了普通PCR特異性強、靈敏度高的優點，而且具有節約時間、節省人力物力等優點（趙樸等，2014），因此，多重PCR技術已廣泛應用于核酸檢測的多個領域，包括基因多態性分析、基因突變位點檢測、基因缺失分析及病原體核酸檢測等。隨著規?；B雞業的快速發展，雞傳染病的發生越來越復雜，混合或繼發感染日益多發，特別病毒混合或繼發感染更為常見，為方便、快速診斷混合或繼發感染，多重PCR技術越來越多地應用于雞病毒性傳染病的診斷中，現就多重PCR在雞病毒性傳染病診斷中的應用研究進展進行綜述，以供參考。

1 雞呼吸道傳染病診斷

引起雞呼吸道傳染病的病毒很多，如新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）和傳染性支氣管炎病毒（IBV）等，而且這些病毒常?；旌匣蚶^發感染，給養雞業造成了嚴重的經濟損失，也給獸醫臨床診斷造成了重要障礙，多重PCR技術的應用有效解決了這一難題。

為有效檢測禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒，黃淑堅等（2006）利用分子生物學方法,選擇禽流感病毒的M基因、新城疫病毒的F基因以及傳染性支氣管炎病毒的N基因,分別在基因序列的保守區域設計1對特異性引物,利用所合成的3對引物對相應靶基因進行RT-PCR擴增,建立禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎病毒多聯RT-PCR的檢測方法，結果表明：這3對引物分別能特異性地擴增出禽流感病毒的M基因片段、新城疫病毒的F基因片段及傳染性支氣管炎病毒的N基因片段,大小分別為385 bp、520 bp和748 bp。為使檢測更加簡便，趙建梅等（2003）建立了一步法多重RT-PCR檢測新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎病毒。王非等（2007）建立了可同時檢測雞ILV、IBV、NDV和AIV多重RT-PCR，試驗結果表明，所設計的4對引物可對同一樣品中的ILV、IBV、NDV和AIV進行特異性擴增，所擴增的目的片斷的長度分別為620 bp（ILV）、445 bp（IBV）、344 bp（NDV）和240 bp（AIV）；建立的RT-PCR檢測方法能夠檢測出10 pg AIV、1 ng NDV和10 ng IBV的RNA及100 pg ILV的DNA。隨后，Rashid等（2009）建立了同時檢測的H7、H9和H5 3種常見亞型AIV及NDV、IBV和ILTV3種常見呼吸道病毒的多重PCR，該多重PCR能快速鑒別H7、H9和H5，對于控制疾病AIV在雞群和人群中傳播非常重要，同時該多重PCR能鑒定雞群混合感染中3種常見呼吸道病毒，因此有助于降低這些病毒造成的經濟損失。

多重PCR可有效鑒定病毒亞型。wu等（2013）建立了檢測A型流感病毒及H1、H3、H5和H9亞型AIV的多種PCR，A型流感病毒、H1、H3、H5和H9亞型AIV的擴增產物分別為239 bp、612 bp、187 bp、338 bp和289 bp，敏感性和傳統PCR敏感性相當，該方法是快速、方便、廉價地大規模篩選臨床樣品的有效工具。

2 雞免疫抑制病診斷

免疫抑制病病毒如馬立克氏病病毒（MDV）、法氏囊病病毒（IBDV）、白血病病毒（ALV）、傳染性貧血病毒（CIAV）、網狀內皮增生癥病毒REV）、呼腸孤病毒（ARV）等，不僅引起病雞的死亡、淘汰，而且會引起免疫抑制，導致感染雞免疫失敗，并且免疫抑制病毒常見于混合或繼發感染，給養雞業造成了重要經濟損失。多重PCR是檢測雞免疫抑制病毒的有效手段。

為有效檢測雞群中的ARV、REV與ALV，畢研麗等（2012）建立了三重PCR，試驗結果表明，該三重PCR方法可對同一樣品中的ARV、REV、ALV進行特異性擴增，產物分別為247 bp、675 bp和467 bp，檢測敏感性分別為10 pg的ALV、1pg的ARV和10 pg的REV模板。為鑒定ALV的亞群，管宏偉等（2012）建立了能特異性檢測禽白血病病毒A、B、J亞群的多重PCR，擴增產物分別為195、260、924 bp，檢測的最小拷貝數是103，為禽白血病病毒感染的臨床診斷及流行病學調查研究提供了有效手段。

3 小結

雞病毒性傳染病的種類多、傳播快、流行廣，給國內外養雞業造成重大的經濟損失，特別是伴隨養雞業的規?；图s化發展，多種病毒引發的混合感染或繼發感染在雞群中越來越常見，給雞病毒性傳染病的臨床診斷造成了重要障礙。在普通PCR技術基礎上發展起來的多重PCR技術，可同時檢測多個病毒，不僅省時省力，節約單個病毒的檢測成本，而且可以提高樣本的使用率，在雞病毒性傳染病的診斷研究方面取得的重要進展，正如前文所述，在雞呼吸道傳染病、雞免疫抑制病方面已經建立了有效的多重PCR方法。然而，多重PCR體系中多對引物間的相互干擾和非特異性擴增，限制了多重PCR的敏感性和特異性，為此，已有科研人員開發了新的多重PCR技術，如雙啟動寡核苷酸引物技術、多重連接依賴式探針擴增技術和靶序列富集多重PCR等，這些技術有效提高了多重PCR的敏感性和特異性。相信，伴隨多重PCR技術的不斷改進，會有越來越多的多重PCR方法應用于雞病毒性傳染病的診斷研究中，為養雞業的健康發展保駕護航?！?/p>

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：1004-5090（2017）01-0048-02