微生物絮凝劑γ-聚谷氨酸的生產及應用研究進展

邵 穎，趙彩鳳，邵 賽，張樂平

（湖南省農業科學院核農學與航天育種研究所，湖南省農業生物輻照工程技術研究中心，生物輻照技術湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410125）

微生物絮凝劑γ-聚谷氨酸的生產及應用研究進展

邵 穎，趙彩鳳，邵 賽，張樂平

（湖南省農業科學院核農學與航天育種研究所，湖南省農業生物輻照工程技術研究中心，生物輻照技術湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410125）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是由L-谷氨酸或D-谷氨酸通過肽鍵結合形成的一種多肽高分子，具有良好的水溶性、生物相容性、水解性、生物可降解性、無毒等優良特性。文章綜述了微生物合成γ-PGA生產工藝，如生產菌株、培養基優化、發酵工藝和固定化技術等，介紹了γ-PGA在廢水處理方面的應用，并指出了其發展方向。

γ-聚谷氨酸；生物合成；廢水；應用；綜述

微生物絮凝劑（Microbial flocculants，簡稱MBF）是利用生物技術，從微生物菌體或其分泌物中提取、純化而獲得的一種安全、高效，且能生物降解的新型水處理絮凝劑[1]。MBF可以克服無機高分子和合成有機高分子絮凝劑本身固有的安全和環境污染方面的缺陷，易于生物降解、無毒、無二次污染。生物絮凝劑已應用于紙漿廢水、染料廢水處理、污泥脫水及發酵菌體去除[1-2]等領域。MBF活性成分有糖蛋白、多糖、蛋白質、纖維素、DNA以及具有絮凝活性的菌體等[3]。目前，MBF存在價格昂貴、絮凝活性不高、投加量大等缺點，其工業化應用不多。

γ-聚谷氨酸（γ-Polyglutamic acid，γ-PGA）是一種由芽孢桿菌（主要為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）合成的細胞外水溶性氨基酸聚合物。γ-PGA由L-谷氨酸和D-谷氨酸單體通過α-氨基和γ-羧基形成肽鍵之后生成的線型同聚酰胺，分子量一般在100～1 000 kDa[4]。γ-PGA分子中每個重復單元的α碳原子上連有一個羧基，可在分子內和分子間形成氫鍵。γ-PGA是一種陰離子聚合氨基酸，其二級結構在不同pH和離子強度下呈現不同構象[5]。γ-PGA分子中富含-COOH、-CO-、-NH-等多種活性基團，電荷密度高，分子量較大且呈線性，具有良好的絮凝活性。目前，高生產成本（高原料成本與復雜的分離純化工藝），低產量是制約γ-PGA工業化應用的重要因素。

γ-PGA具有優良的成膜性、成纖維性、阻氧性、粘結性、可塑性、吸水性和生物可降解性等特性，使其具有成膜、增稠、乳化、凝膠、保溫、助溶、粘結和緩釋等功能[4,6]，在水處理、醫藥、食品、農業、化妝品等領域具有廣闊的應用前景。本文主要對微生物絮凝劑γ-聚谷氨酸的發酵生產工藝及在廢水處理方面的應用、國內外發展動態及研究現狀進行綜述。

1 γ-PGA的發酵生產工藝

1.1 γ-PGA生產菌株

γ-PGA生產菌株主要為芽孢桿菌。根據合成γ-PGA過程中是否需要谷氨酸將其分為谷氨酸依賴型和谷氨酸非依賴型γ-PGA生產菌。非依賴型γ-PGA生產菌由于培養基不需要提供谷氨酸，原料成本較低，但是γ-PGA產量一般較低（10 g/L左右）。谷氨酸依賴型γ-PGA生產菌產量較高（大于20 g/L），但原料成本較高[7-9]。

1.2 優化培養

碳源、金屬離子、前體物質、微量元素、生物素等對不同菌株的產量存在很大差異。培養基組成和含量，溫度、pH、供氧等發酵條件對γ-PGA產量和分子量大小和分布影響較大。

多篇報道采用響應面法（RSM）或正交設計（PB設計）法對γ-PGA發酵培養基進行優化。Chen等[10]采用RSM對Bacillus subtilis CCTCC202048固態發酵生產γ-PGA培養基進行了優化，在最優發酵條件下，γ-PGA產量為4.7%（w/w）。Soliman等[11]采用PB設計對谷氨酸非依賴菌Bacillus sp. SBA-26培養基成分的15個變量進行優化，結果發現K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4和酪蛋白水解物是影響γ-PGA產量的主要組分，在優化培養基條件下，γ-PGA最大產量為33.5 g/L。Yong等[9]采用RSM優化B. amyloliquefaciens C1固態發酵培養基，γ-PGA最大產量達4.37%。Bajaj等[8]采用因子分析法、PB設計和RSM等多種方法對B. licheniformis NCIM 2324生產γ-PGA培養基進行了優化，產量從5.27 g/L提高到26.12 g/L。Shi等[9]采用RSM優化B. subtilis ZJU-7培養基組分，γ-PGA產量提高了1倍，達58.2 g/L?？梢?，通過統計法可以使γ-PGA產量不同程度提高，同時減少工作量。

1.3 發酵工藝

在高黏性產物好氧發酵生產過程中，提高溶氧和氧傳質效率對于提高目標產物產量和生產速率非常關鍵。目前，提高溶氧的技術有微孔曝氣技術、膜生物反應器等[12]。在γ-PGA生物發酵生產過程中，由于其高粘度特性，導致中后期發酵液粘度較大，嚴重影響混合、傳氧和傳質過程，進而影響γ-PGA產量、分子量大小和分子量分布等[13]。Bajaj等[14]研究表明，高轉速和高通氣量可促進B. licheniformis NCIM 2324生長，當攪拌轉速低于750 r/min時，γ-PGA產量隨轉速增加而增大，當轉速為750 r/min，通氣量1 vvm時，γ-PGA最大產量為46.34 g/L。Cromwick等[8]研究了曝氣和pH等因素對B. licheniformis ATCC 9945A分批發酵生產γ-PGA產量影響，結果表明，在最適pH 6.5條件下，攪拌速率從250 r/min提高到800 r/ min，曝氣量從0.5 L/min增大到2.0 L/min，γ-PGA產量從6.3 g/L增加到23 g/L，盡管如此，局部溶氧限制仍不可避免。符爽等[15]采用離心式纖維床生物反應器（Centrifugal Fibrous-Bed Bioreactor，CFBB）生產γ-PGA，以強化傳質及傳氧過程，結果發現CFBB中發酵液的最高黏度為4 000 mPa·s，低于攪拌釜式發酵罐，低粘度有利于氧傳質，可連續生產γ-PGA。

1.4 固定化菌生產γ-PGA

細胞固定化技術可以實現細胞的重復利用，有利于產品的分離純化，簡化后處理工藝，縮短生產周期，可實現連續或半連續生產，從而降低發酵成本。采用固定化細胞發酵，可以得到含菌量很少甚至不含菌體的發酵液。易于實現產物分離與發酵耦合，減少菌體分離成本，促進工業化應用[15]。在高粘性黃原膠、魯蘭多糖等胞外多糖發酵生產中，固定化細胞研究較多，這對高粘性的γ-PGA生產同樣適用[16-17]。Hsu等[16]利用棉纖維固定化Xanthomonas campestris細胞生產黃原膠，產量為游離細胞的2倍。West等[17]利用殼聚糖微球固定化Aureobasidium pullulans ATCC 201253生產普魯蘭多糖，應用1%殼聚糖小球固定化菌株重復生產2批次，第2批次產量（5.0 g/L）為第1批次（3.1 g/L）的1.6倍。Zhang等[13]利用聚氨酯泡沫固定化X. campestris CGMCC 1.1781固態發酵生產黃原膠，黃原膠產量為42.62 g/L，約為深層通氣發酵產量的2倍。在γ-PGA微生物合成研究中，關于細胞固定化報道較少。Berekaa等[18]研究了包埋法和吸附法固定化B. lichenniformis strain-R生產γ-PGA，結果表明吸附法優于包埋法，最適固定化載體為海綿。以海綿固定化細胞strain-R，在柱式滴流床反應器進行批次半連續生產γ-PGA，第3批次γ-PGA產量最大，為55.5 g/L，第4批次γ-PGA產量略微下降。

2 γ-PGA廢水處理方面的應用

γ-PGA為線型聚陰離子高分子，具有水溶性聚羧酸的性質，有強吸水性和金屬螯合性，可用作絮凝劑[19]。作為一種新型微生物絮凝劑，γ-PGA具有生物可降解性、水溶性、無毒和環境友好等優點，在水處理方面應用前景廣闊[20]。

在γ-PGA絮凝活性研究方面，Yokio等[21]考察了Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等金屬離子作為γ-PGA助凝劑對高嶺土懸浮液的絮凝活性影響，結果表明，Ca2+對γ-PGA助凝效果最佳，最適pH為4。Shih等[41]也考察了金屬離子和pH對絮凝活性的影響，發現Ca2+為最佳助凝離子，最佳絮凝pH為中性。Bajaj等[23]采用響應面法對B. subtilis R 23生產的γ-PGA最佳絮凝條件進行了優化，在最佳條件下，絮凝活性達到最大30.32±1.4 1/OD。Wu等[3]對B. subtilis DYU1發酵產物（主要成分為γ-PGA）的絮凝性能進行了研究，對γ-PGA絮凝高嶺土的機理進行了初步推測，但實驗數據不充分。Taniguchi等[24]對γ-PGA進行了交聯改性，并研究了其物理化學性能及其對高嶺土的絮凝活性。采用改性γ-PGA和無機絮凝劑聚合氯化鋁復配使用，絮凝活性顯著提高。

在廢水脫色方面，Inbaraj等[25]研究γ-PGA包裹的磁性納米顆粒對亞甲基藍染料吸附特性，最大吸附容量達78.67 mg/g。Inbaraj等[26]研究了γ-PGA對陽離子型染料堿性藍9（BB9）和堿性品綠4（BG4）的吸附，飽和吸附量分別為352.76和293.32 mg/g。Deng等[2]利用Aspergillus parasiticus產生的絮凝劑對8種染料進行了處理，對活性藍4和酸性黃25的處理效率分別達到了92.4%和92.9%。

工農業廢水、城市生活污水及各種采礦廢水均含有大量的金屬離子，這些重金屬通過食物鏈生物富集，嚴重威脅生物和人體健康。目前應用的廢水處理方法分為化學法、物理法和生物法。利用微生物絮凝劑對廢水中的重金屬進行處理，是近年來研究的熱點。在重金屬去除方面，Mark等[27]研究發現，B. licheniformis ATCC 9945生產的γ-PGA對Cu2+有很強的吸附能力和吸附容量，可用于除去廢水中的重金屬離子，用于回收金屬和減少環境污染等。徐虹等[28]研究發現γ-PGA能有效降低電鍍廢水中Cr3+、Ni2+等金屬離子濃度。Inbaraj等[29]研究發現γ-PGA吸附汞（Ⅱ）為放熱自發的反應，吸附動力學符合準二級，5 min吸附量可達80 mg/L。Yao等[30]應用Bacillus subtilis NX-2所產的γ-PGA吸附電鍍廢水中微量重金屬離子，Cr（Ⅲ）從3.07 mg/L降至0.15 mg/L，Ni（Ⅱ）從9.46 mg/L降至1.01 mg/L，達到排放標準。

3 展 望

γ-PGA從原材料、生產過程和產品性能均能實現真正意義上的“綠色”，具有廣闊的發展前景和巨大的開發潛力。然而，亟需解決的是如何降低生產成本和控制產物結構（L-/D-單體比例）、分子量等。根據國內外發展現狀，筆者認為γ-PGA的研究方向將主要集中在以下兩個方面[31]：一方面繼續尋找能夠利用廉價的原料高效高產γ-PGA的優良菌株，尤其是谷氨酸非依賴性合成菌，如采取與谷氨酸生產菌共混發酵法，或利用煙草葉肉細胞、谷氨酸棒桿菌作為宿主實現γ-PGA合成酶表達，降低生產成本；另一方面致力于對γ-PGA合成工藝及合成機制的探討。發酵液粘度隨γ-PGA濃度增加而增大。高粘性引起的傳氧和傳質限制是導致發酵產量低的重要影響因素之一。因此，高效、低能耗曝氣方式的研究將有效的提高γ-PGA的產量。同時通過染色體融合、合成酶表面修飾、基因剪切等生物化學與分子生物學方面深入研究，結合基因和蛋白組數據庫、模擬基因表達和酶系催化，實現γ-PGA的體外合成控制，為γ-PGA大規模生產和應用提供理論基礎與技術支撐。

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（責任編輯：夏亞男）

Research Progress on Production and Application of Bioflocculantγ-Polyglutamic Acid

SHAO Ying，ZHAO Cai-feng，SHAO Sai，ZHANG Le-ping
（1. Institute of Nuclear Agricultural Science and Space Mutation Breeding, Hunan Academy of Agriculture Sciences, Hunan province Engineering Technology Research Center of Agricultural Biological Irradiation, Hunan province Biological Irradiation Techonology Engineering Research Center, Changsha 410125, PRC）

γ-polyglutamic acid is a polypeptide composed of L-glutamic acid or D-glutamic acid by peptide bond formation. γ-PGA is a promising environmental friendly material with outstanding water solubility, biocompatibility, hydrolysis, biodegradability and nontoxic. This paper reviews the microbial synthesis of γ-PGA production processes, such as the production of strains, medium optimization, fermentation technology and immobilization technology. Meanwhile, it focuses on the application of γ-PGA in wastewater treatment, and points out the development direction in the future.

γ-polyglutamic acid; biosynthesis; wasterwater; application; review

X703.5

：A

：1006-060X（2017）08-0123-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.008.032

2017-06-06

湖南省農業生物輻照工程技術研究中心科學基金開放項目（2016KF002）；湖南省農業科學院科技創新項目（2016QN09）；湖南省環境保護廳科研課題（湘財建指〔2016〕59號）

邵 穎（1965-），女，湖南湘陰縣人，副研究員，主要從事核輻射與環保新材料研究。

邵 賽