草豆蔻中的山姜素與血紅蛋白的相互作用

許安琪，吳寧寧，吳雪春，劉 平，姚小軍，陳光英，何文英,*

（1.海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海南 海口 571158；2.蘭州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.海南師范大學(xué) 熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571158）

草豆蔻中的山姜素與血紅蛋白的相互作用

許安琪1，吳寧寧1，吳雪春1，劉 平1，姚小軍2，陳光英3，何文英1,*

（1.海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海南 海口 571158；2.蘭州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.海南師范大學(xué) 熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571158）

利用多種熒光光譜法、紫外光譜法并結(jié)合分子模擬等方法，表征模擬生理?xiàng)l件下草豆蔻中的主要活性組分山姜素（alpinetin，Alp）影響牛血紅蛋白（bovine hemoglobin，BHG）的結(jié)構(gòu)信息，探討Alp與BHG的作用機(jī)制。重疊光譜數(shù)據(jù)證實(shí)，Alp與BHG的相互作用符合F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移，據(jù)此依據(jù)不同的作用機(jī)理，獲得3 種溫度（299、309、319 K）條件下的鍵合常數(shù)（猝滅機(jī)理為5.880×104、4.337×104L/mol及4.935×104L/mol；增敏機(jī)理為3.239×103、5.225×103L/mol及7.692×103L/mol）及熱力學(xué)常數(shù)（ΔS：182.073 J/（mol·K），ΔH：34.320 kJ/mol，ΔG：－20.119（299 K）、－21.940 kJ/mol（309 K）及－23.760 kJ/mol（319 K））；分子模擬表明，Alp鍵合位點(diǎn)于BHG分子的疏水腔內(nèi)，并與BHG的鍵合模式主要是疏水作用；熒光偏振顯示，Alp與BHG結(jié)合后生成的配合物弛豫時(shí)間較短，結(jié)合的較松；同步熒光及紫外光譜證實(shí)，Alp的存在影響了BHG的微環(huán)境；二維及三維熒光光譜表明，Alp可以猝滅BHG的內(nèi)源熒光，使其構(gòu)象發(fā)生變化。結(jié)論表明，BHG對(duì)Alp有較強(qiáng)的結(jié)合能力，提示BHG對(duì)Alp在一定程度上可起到貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。另外，考察了幾種共存金屬離子對(duì)Alp與BHG相互作用的影響，表明加入共存離子后的鍵合常數(shù)均有較大增加。

山姜素；血紅蛋白；能量轉(zhuǎn)移；相互作用

草豆蔻為姜科植物草豆蔻的成熟的種子團(tuán)，含揮發(fā)油，其主要成分為山姜素（aipinetin，Alp）、小豆蔻明、桉葉素和金合歡醇，食用有祛寒燥濕、健脾消食的作用，常用作調(diào)味品，可去除異味，增加香味。其中Alp為草豆蔻中主要的一種黃酮類成分，其藥理活性主要表現(xiàn)在抗炎抑菌、抑制腫瘤形成及血小板聚集，且毒性很低，安全性好[1]。近幾年，國內(nèi)外雖已有較多關(guān)于Alp新的藥理活性的研究報(bào)道[2-3]，也有其與模型蛋白（人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）或牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA））相互作用的研究報(bào)道[4-6]，但其與血紅蛋白的相互作用卻鮮見報(bào)道。血紅蛋白是高等生物體內(nèi)的一種重要的生物大分子，主要存在于某些無脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物血液和豆科植物根瘤中，其主要功能是運(yùn)輸氧、維持血液酸堿平衡[7]。通過研究Alp與血紅蛋白的相互作用，與文獻(xiàn)中報(bào)道的與其他模型蛋白作用的結(jié)果相比較，可為Alp分子結(jié)構(gòu)與藥效之間關(guān)系提供更加有用的信息，比如結(jié)合的緊密程度、結(jié)合力、作用模式、結(jié)合數(shù)、結(jié)合部位等參數(shù)，不僅有助于從分子層次上闡明Alp與血紅蛋白的作用機(jī)理及其對(duì)相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響，并且能深入認(rèn)識(shí)Alp藥效作用的藥理、毒物毒性作用的毒理之微觀機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)合理用藥也具有一定實(shí)際應(yīng)用意義。

本實(shí)驗(yàn)利用紫外光譜、多種熒光光譜及分子模擬等技術(shù)探討Alp與牛血紅蛋白（bovine hemoglobin，BHG）的鍵合作用，基于Alp特殊的分子結(jié)構(gòu)及能量轉(zhuǎn)移原理獲得詳細(xì)的鍵合參數(shù)，從分子水平揭示它們的相互作用機(jī)理，并探討幾種常見的金屬離子共存時(shí)的影響，研究結(jié)果為揭示Alp作為一種藥食同源植物草豆蔻的重要組分在體內(nèi)的運(yùn)輸、吸收和代謝提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BHG（相對(duì)分子質(zhì)量64 500） 美國Worthington Biochemical公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl) metyl aminomethane，Tris）-鹽酸（Tris-HCl）緩沖溶液國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Alp 中國食品藥品檢定研究院。

1 000 mg/L金屬離子（Zn2＋、Fe3＋、Na＋、Mn2＋、Al3＋、Ca2＋） 國家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院。根據(jù)不同金屬離子的分子質(zhì)量，從1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)金屬離子中移取不同體積的金屬離子，用超純水配制成1.0×10－3mol/L。

所有實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；試劑均為分析純。3.0×10－5mol/L BHG溶液用Tris-HCl緩沖溶液（pH 7.40）配制，于 4 ℃保存于暗處；0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液、1 000 mg/L金屬離子用蒸餾水配制；1.0×10－3mol/L Alp用無水甲醇配制。

1.2 儀器與設(shè)備

RF-5301PC熒光光度計(jì) 日本島津公司；F-7000熒光光度計(jì) 日本日立公司；BS124S電子天平德國賽多利斯公司；PHSJ-3F pH計(jì) 上海精密儀器廠；SB-1000型水浴鍋 上海愛朗儀器有限公司；TU-1901型紫外-可見光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；pHs-10A型酸度計(jì) 蕭山市科學(xué)儀器廠。實(shí)驗(yàn)所需溫度用超級(jí)恒溫槽控制。

1.3 方法

1.3.1 能量轉(zhuǎn)移的測(cè)定

在RF-5301PC熒光光譜儀上進(jìn)行發(fā)射光譜的測(cè)定（1 cm石英池），BHG濃度為3.0×10－5mol/L，選激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm；在TU-1901型紫外-可見光光度計(jì)進(jìn)行吸收光譜的測(cè)定（1 cm石英池），配制同濃度的Alp溶液，相應(yīng)的試劑的空白作參比溶液，掃描Alp在波長(zhǎng)200～350 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜，依據(jù)文獻(xiàn)[8]計(jì)算并確定能量轉(zhuǎn)移。

1.3.2 鍵合常數(shù)及熱力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

在RF-5301PC熒光光譜儀上進(jìn)行測(cè)定（1 cm石英池），采用熒光滴定法，選擇激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為348 nm，在299、309 K和319 K 3 種不同溫度條件下測(cè)定Alp-BHG體系的熒光強(qiáng)度，再依據(jù)文獻(xiàn)[9]計(jì)算鍵合常數(shù)。

1.3.3 同步熒光及熒光偏振度的測(cè)定

均在RF-5301PC熒光光譜儀上進(jìn)行測(cè)定（1 cm石英池），熒光偏振選激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為348 nm[10]；同步熒光（Δλ=60 nm）以230 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，290 nm為發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 三維熒光光譜的測(cè)定

在F-7000熒光光譜儀上進(jìn)行（1 cm石英池），選激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)230～325 nm、發(fā)射波長(zhǎng)230～480 nm范圍的三維熒光譜圖。

1.3.5 紫外吸收光譜的測(cè)定

在TU-1901型號(hào)紫外-可見光光度計(jì)上進(jìn)行（1 cm石英池），依次移取一定量的Alp和BHG儲(chǔ)備液，用pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液定容為3 mL，以相應(yīng)試劑的空白為參比，測(cè)定Alp-BHG體系在200～350 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。

1.3.6 分子模擬

首先應(yīng)用SYBYL 7.3軟件得到Alp的三維結(jié)構(gòu)，再對(duì)各種最合理分子的初步構(gòu)象進(jìn)行Tripos力場(chǎng)的能量?jī)?yōu)化，以生成熱（能量）最低者為藥效構(gòu)象；進(jìn)一步用共軛梯度法優(yōu)化Alp的分子結(jié)構(gòu)。BHG的晶體結(jié)構(gòu)（編號(hào)為4M4B）從Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得，通過kollman-all-atom電荷測(cè)出BHG蛋白三維結(jié)構(gòu)的勢(shì)能；最終用Surf l ex程序模擬出Alp和BHG分子相互作用的模式。1.3.7 金屬離子共存時(shí)鍵合常數(shù)的測(cè)定

競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)：依次向1 mL比色皿中加入一定量的BHG儲(chǔ)備液（3.0×10－6mol/L）、分別不同離子的溶液（Zn2＋、Fe3＋、Na＋、Mn2＋、Al3＋、Ca2＋，濃度均配制成為1.0×10－3mol/L），以pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液定容，逐步加入Alp，激發(fā)波長(zhǎng)278 nm，發(fā)射波長(zhǎng)445 nm，反應(yīng)時(shí)間3 min，測(cè)定299 K條件下的熒光強(qiáng)度，所得結(jié)果用來計(jì)算鍵合常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alp與BHG相互作用的能量轉(zhuǎn)移

根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，若能量轉(zhuǎn)移受體吸收譜和給體的熒光發(fā)射譜之間有一定的光譜重疊，且供能體與受能體足夠接近，最大距離不超過7 nm，則可以確定在熒光能量的受體和給體分子之間發(fā)生了基于電子激發(fā)能的非輻射轉(zhuǎn)移，其轉(zhuǎn)移是通過分子間偶極-偶極耦合作用發(fā)生的[5]。

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要是色氨酸殘基產(chǎn)生的，通過測(cè)定BHG在熒光激發(fā)波長(zhǎng)280 nm的發(fā)射光譜與Alp的吸收光譜，得到其重疊光譜圖（圖1），依據(jù)公式（1）～（3）計(jì)算出Alp在BHG上的結(jié)合位置與色氨酸殘基之間的距離r[4-5]：

式中：E為能量轉(zhuǎn)移效率；R0為轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離/nm；r為熒光體與淬滅體之間的真實(shí)距離/nm；F和F0分別為存在和不存在能量受體時(shí)，能量給體的熒光發(fā)射強(qiáng)度。

式中：K2為偶極空間取向因子（K取2/3）；n為介質(zhì)的折射指數(shù)（n取1.336）；Φ為熒光給體的熒光量子產(chǎn)率（Φ取0.118）[5]；J為給體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜之間的光譜重迭積分。

式中：F（λ）為熒光給體在波長(zhǎng)為l時(shí)的熒光強(qiáng)度；ε（λ）為受體在波長(zhǎng)λ時(shí)的摩爾消光系數(shù)/（L/mol）。計(jì)算得到重疊積分（J）的數(shù)值為4.0 0 3×1 0－14（cm3·L）/mol，臨界距離R0為4.25 nm，BHG中色氨酸殘基與已結(jié)合的Alp分子間的距離r值為6.02 nm。結(jié)果表明：Alp在BHG的結(jié)合位置與Trp殘基之間的距離小于7 nm，同時(shí)也證明了在Alp和BHG分子之間發(fā)生了基于電子激發(fā)能的非輻射轉(zhuǎn)移（圖1）。

圖1 BHG的熒光光譜（a）與Alp的吸收光譜（b）重疊圖Fig.1 Overlapping between the fl uorescence emission spectrum of BHG (a) (λex= 278 nm) and the UV spectrum of Alp (b)

圖2 Alp-BHG體系的熒光發(fā)射光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of Alp-BHG system

2.2 Alp與BHG的鍵合機(jī)理及熱力學(xué)參數(shù)Alp及BHG-Alp體系的熒光發(fā)射光譜圖（Ex=278 nm）。可看出，BHG的最大發(fā)射波長(zhǎng)位于327 nm，加入Alp后，其紅移至341 nm左右；而Alp的最大發(fā)射波長(zhǎng)位于438 nm，加入BHG后，在438 nm的強(qiáng)度有較大的增加。由圖2可知，隨著Alp濃度的增加，BHG-Alp體系的熒光發(fā)射光譜圖（λex=278 nm）可以更加明顯地看出在368 nm波長(zhǎng)處存在一個(gè)共發(fā)射點(diǎn)，對(duì)應(yīng)在BHG的特征最大發(fā)射波長(zhǎng)325 nm處，Alp猝滅了BHG的內(nèi)源熒光；而在Alp的特征最大發(fā)射波長(zhǎng)432 nm處BHG增敏了Alp的熒光，且都有紅移效應(yīng)。結(jié)果說明：Alp與BHG發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用；且Alp的存在，發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移給體BHG與受體Alp分子間偶極-偶極耦合作用，使得BHG的熒光減弱而Alp的熒光增強(qiáng)。

應(yīng)用熒光滴定法測(cè)定3 個(gè)不同溫度（299、309、319 K）的熒光強(qiáng)度。選BHG的最大發(fā)射波長(zhǎng)327 nm處的熒光強(qiáng)度，制作Stern-Volmer圖（圖3）及猝滅機(jī)理KSV值（表1），可看出溫度的變化對(duì)Alp-BHG體系的熒光強(qiáng)度影響較大；通過線性模擬獲得猝滅曲線的斜率即猝滅機(jī)理KSV值（均為104數(shù)量級(jí)），并計(jì)算得到猝滅速率常數(shù)（均大于2.0×1010L/（mol·s）），再結(jié)合Alp-BHG體系的吸收光譜（圖4），證明Alp對(duì)BHG的熒光猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅[11]。

圖3 Alp-BHG體系的猝滅機(jī)理Stern-Volmer圖Fig.3 Stern-Volmer plots of Alp-BHG systems

表1 不同溫度條件下Alp與BHG的鍵合常數(shù)值Table1 Binding parameters between Alp and BHG under different temperatures

在Alp的熒光發(fā)射峰438 nm波長(zhǎng)處，應(yīng)用熒光加強(qiáng)效應(yīng)及相關(guān)的公式[12]求得不同溫度條件下的鍵合常數(shù)K值（表1、圖5），可看出隨溫度的升高，K值呈增大的趨勢(shì)。結(jié)果表明，Alp與BHG以一對(duì)一的位點(diǎn)相互作用，且K值受溫度的影響較大。

圖4 Alp-BHG體系及Alp的紫外光譜圖Fig.4 UV absorption spectra of Alp-BHG and Alp (inset) in Tris buffer solution (at 299 K)

圖5 Alp-BHG體系的增敏機(jī)理圖Fig.5 Plots for sensitivity enhancement mechanisms of Alp-BHG systems

利用Van’t Hoff方程可求得Alp與BHG作用的熱力學(xué)常數(shù)[13]，根據(jù)不同溫度條件下K值（表1）求得ΔS值為182.073 J/（mol·K），ΔH值為34.320 kJ/mol，ΔG值分別為：－20.119（299 K）、－21.940 kJ/mol（309 K）及－23.760 kJ/mol（319 K），表明Alp與BHG的鍵合過程是自發(fā)進(jìn)行的；ΔH值及ΔS值表明它們之間為典型的疏水作用力，這與后面有關(guān)分子模擬的結(jié)果相一致。

2.3 Alp與BHG相互作用的分子模擬

BHG結(jié)構(gòu)上是具有4 個(gè)亞單元的聚合體，每個(gè)亞單元由一條蛋白鏈和一個(gè)血紅素分子組成。血紅素與肽鏈的連接是通過血紅素中鐵原子的第5配位點(diǎn)與肽鏈分子中的組氨酸咪唑基的氮原子相連而成，在鐵原子的第6配位點(diǎn)可與氧或其他小分子結(jié)合[14]。

圖6 Alp鍵合BHG的分子模擬對(duì)接圖Fig.6 Binding mode between Alp and BHG with only residues around 8 ? in Alp being displayed

從圖6可以看出，BHG分子的部分區(qū)域有相應(yīng)的空間接納Alp分子，Alp分子嵌合在BHG分子的疏水腔內(nèi)，且整個(gè)Alp分子表現(xiàn)為非平面結(jié)構(gòu)，與BHG分子的酪氨酸Tyr-35、苯丙氨酸Phe-36和色氨酸Trp-37很靠近，這一方面說明Alp與BHG通過疏水作用鍵合，另一方面表明Alp確實(shí)能猝滅BHG的內(nèi)源熒光，與本研究前面的有關(guān)熒光光譜法的測(cè)定結(jié)果一致。分子模擬結(jié)果說明Alp鍵合BHG的作用力的模式主要是疏水作用，且是自發(fā)進(jìn)行的，與本研究后面有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算結(jié)果一致。

2.4 Alp影響B(tài)HG二級(jí)結(jié)構(gòu)的光譜表征

圖7 BHG的各向異性值Fig.7 Variation in the fl uorescence anisotropy of BHG with increasing Alp concentration. Inset: Variation with increasing BHG concentration

熒光偏振法通過測(cè)定熒光偏振值或各向異性值的變化，能確定溶液中藥物小分子與生物大分子結(jié)合的一些參數(shù)，是一種研究分子間相互作用的靈敏而高效的方法[15]。圖7為溫度為299 K條件下，Alp的濃度為4.0×10－5mol/L時(shí)測(cè)得不同濃度BHG的各向異性值，可看出，Alp的存在，使得BHG的各向異性值呈增大趨勢(shì)（0.000 9～0.201 0）；而其中的附圖為改變Alp的濃度而測(cè)得的BHG（5.0×10－6mol/L）的各向異性值，隨著Alp與BHG濃度比的增大（0.0～4.0×10－5mol/L），各向異性值均在0.13左右。以上兩個(gè)體系的各向異性值均小于0.4，說明Alp與BHG結(jié)合的程度較小，其生成的配合物有較短的弛豫時(shí)間；從蛋白的角度看，是由于Alp的存在，使得BHG的二級(jí)結(jié)構(gòu)從螺旋伸展到無規(guī)卷曲時(shí)撓性增大，因而偏振值較小[16]。

蛋白質(zhì)肽鍵的紫外最強(qiáng)吸收峰約在210 nm波長(zhǎng)處，反映蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)的光譜信息[17]。圖4中的曲線1為純BHG在Tris水溶液中的紫外吸收?qǐng)D譜，在205 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，隨Alp濃度的增大，在322 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)雙峰譜圖，對(duì)比附圖中曲線，得知322 nm波長(zhǎng)處為Alp的特征吸收峰。附圖曲線顯示了Alp的紫外吸收為典型的雙峰譜圖，在208、322 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。正圖中的紫外光譜圖顯示：隨Alp濃度的增加，相應(yīng)Alp-BHG體系的吸收強(qiáng)度也增大，與附圖中Alp的最大吸收波長(zhǎng)位置相比未發(fā)生明顯變化，但Alp-BHG體系的峰形與Alp的吸收峰形差異較明顯，以上結(jié)果表明：Alp與BHG的相互作用影響了BHG的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

圖8 Alp-BHG體系的同步熒光光譜圖Fig.8 Synchronous fl uorescence spectra

同步熒光分析法具有簡(jiǎn)化譜圖、提高選擇性及減少光散射干擾等特點(diǎn)[16]，通過測(cè)定蛋白質(zhì)Δλ為60 nm的恒波長(zhǎng)同步熒光光譜可以反映色氨酸殘基的變化，從而確定藥物小分子對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響信息[18]。圖8為Alp-BHG體系的恒波長(zhǎng)同步熒光光譜圖（Δλ為60 nm），顯示隨著Alp濃度的增大，Alp能猝滅BHG的色氨酸殘基的熒光，并使得其最大熒光發(fā)射峰有輕微紅移（334～337 nm左右），同時(shí)有能量轉(zhuǎn)移發(fā)生，使得Alp在380 nm 波長(zhǎng)處左右的熒光光譜強(qiáng)度增大，這些結(jié)果說明BHG的色氨酸殘基減少了位于疏水性介質(zhì)的部分，使得BHG的構(gòu)象發(fā)生了一些變化。

圖9 BHG和Alp-BHG體系的三維熒光光譜圖Fig.9 3D Fluorescence spectra of BHG and Alp-BHG system

另外，三維熒光光譜反映測(cè)定體系熒光強(qiáng)度同時(shí)隨激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)變化的情況，可以提供具有熒光性質(zhì)的物質(zhì)的特定光譜的指紋信息[16]。圖9A為BHG的三維等高線熒光光譜，可看出，BHG的最大發(fā)射波長(zhǎng)位于327 nm；圖9B為Alp-BHG體系的三維等高線熒光光譜，顯示了明顯的雙峰圖形，最大發(fā)射波長(zhǎng)位于327 nm及438 nm處，這與用二維熒光光譜測(cè)得的結(jié)果一致。比較圖9A及圖9B，能清楚地看出加入Alp前后，三維等高線熒光光譜和發(fā)射圖譜的圖形形狀均發(fā)生了明顯的變化，均說明Alp猝滅了BHG的內(nèi)源色氨酸殘基的熒光，并且有能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生，再次證實(shí)了前面關(guān)于能量轉(zhuǎn)移的結(jié)論。

2.5 金屬離子對(duì)Alp-BHG體系的影響

大多的金屬離子可以結(jié)合不同蛋白質(zhì)，金屬離子對(duì)生物分子有一定的折疊和交聯(lián)作用，表現(xiàn)在能使某些蛋白質(zhì)極性表面脫水，從而增加蛋白質(zhì)分子間的引力，并且可以降低蛋白質(zhì)分子間負(fù)電荷的排斥作用，因而改變大分子構(gòu)象穩(wěn)定，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子發(fā)生疏水聚集等，尤其對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或催化功能方面，這也有助于修飾和控制蛋白質(zhì)的一些性能[19-22]。

表2 共存離子存在時(shí)對(duì)Alp-BHG體系鍵合常數(shù)K的影響Table2 Binding constantss K ((LL/mol) between Alp and BHG at 296 K in the presence of common ions

選定6 種常見的金屬離子，探討其對(duì)Alp-BHG體系的競(jìng)爭(zhēng)影響作用，結(jié)果見表2，與不加這些金屬離子時(shí)的鍵合常數(shù)相比，加入共存離子后的鍵合常數(shù)值均有較大幅度的增大，尤其是Al3＋和Ca2＋的加入。這表明，幾種金屬離子的存在起協(xié)同作用，增大了Alp與BHG的鍵合，有可能改變了BHG的構(gòu)象。

2.6 比較Alp與BHG、HSA、BSA或其他蛋白的相互作用

利用多種光譜方法（比如熒光光譜法、紫外光譜、紅外光譜、圓二色譜、共振散射及核磁共振等）并結(jié)合分子模擬研究藥物小分子與蛋白質(zhì)相互作用已有很多報(bào)道[23-28]，Alp與不同蛋白的相互作用也已有一些報(bào)道，主要包括的蛋白為：HSA[4]、BSA[5-6]、人免疫球蛋白（human gammaglobulin，HG）[29]及溶菌酶（lysozyme，LYSO）[30]。比較其共同點(diǎn)是：都在模擬生理?xiàng)l件下（pH 7.40）進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)；Alp與這些蛋白的相互作用力的模式均有疏水作用；Alp均可以猝滅這些蛋白的內(nèi)源熒光，猝滅機(jī)理均為靜態(tài)猝滅；熒光發(fā)射光譜都出現(xiàn)雙峰圖形，且都在380 nm波長(zhǎng)處有共發(fā)射點(diǎn)；鍵合常數(shù)均大于104，說明Alp與這些蛋白均有較強(qiáng)的相互作用；Alp的加入均可以不同程度地定性定量影響蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。比較它們的不同點(diǎn)在于：由于Alp與不同所選蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其數(shù)據(jù)及結(jié)果不同；不同研究者所使用的儀器型號(hào)不同，所選的體系濃度范圍各異，造成鍵合常數(shù)、熱力學(xué)常數(shù)等定性的數(shù)據(jù)會(huì)有差別[5-6]。總而言之，以上結(jié)果表明：不同蛋白（BHG、HSA、BSA、HG 及LYSO）均對(duì)Alp有較強(qiáng)的結(jié)合能力，不僅提示這些蛋白對(duì)Alp在一定程度上可起到貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，也暗示Alp與這些蛋白的鍵合有可能是競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制。

3 結(jié) 論

本研究采用光譜法及相關(guān)計(jì)算機(jī)化學(xué)的方法，基于Alp的特殊結(jié)構(gòu)及其光譜性質(zhì)，與BHG鍵合時(shí)能發(fā)生F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移，計(jì)算得到不同溫度條件下的鍵合常數(shù)說明Alp與BHG的鍵合作用較強(qiáng)。計(jì)算機(jī)分子模擬確定了Alp鍵合在BHG的疏水腔內(nèi)，這與熒光滴定實(shí)驗(yàn)得到的熱力學(xué)常數(shù)的計(jì)算結(jié)果（主要是疏水作用）相一致。紫外光譜法及多種熒光光譜法表征了Alp的存在對(duì)BHG的構(gòu)象有一定影響。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均從分子水平上了解了Alp與模型蛋白的鍵合反應(yīng)及作用機(jī)制，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Alp和其他蛋白的相互作用進(jìn)行了比較。

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Interaction of Alpinetin from Alpinia katsumadai with Hemoglobin

XU Anqi1, WU Ningning1, WU Xuechun1, LIU Ping1, YAO Xiaojun2, CHEN Guangying3, HE Wenying1,*
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hainan Normal University, Haikou 571158, China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 3. Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry, Ministry of Education, Hainan Normal University, Haikou 571158, China)

Alpinetin (Alp), a main active component of Alpinia katsumadai, was used to study the mechanism underlying its interaction with hemoglobin (BHG) by fl uorescence polarization, synchronous fl uorescence, 3D fl uorescence and absorption spectroscopy combined with molecular modeling technique under physiological conditions. The data from the overlapping spectra conf i rmed that the interaction between Alp and BHG could be matched with the non-radioactive energy transfer theory. Various binding constants (5.880 × 104, 4.337 × 104and 4.935 × 104L/mol for quenching mechanism; 3.239 × 103, 5.225 × 103and 7.692 × 103L/mol for sensitization effect) and thermodynamic parameters (ΔS： 182.073 J/(mol·K), ΔH： 34.320 kJ/mol, ΔG： -20.119 (299 K), -21.940 (309 K) and -23.760 kJ/mol (319 K)) for Alp-BHG systems were hereby obtained under different temperatures (299, 309 and 319 K) based on different action mechanisms. Molecular docking was performed to reveal the binding of Alp moiety to the hydrophobic cavity of BHG and the acting force was mainly a hydrophobic interaction. The low anisotropy values suggested that there was shorter relaxation time and Alp molecules were observed in a motionally unrestricted environment introduced by BHG. The synchronous fl uorescence and absorption spectra showed that the addition of Alp impacted the microenvironment around BHG in aqueous solution. The 2D and 3D fl uorescence spectroscopy of Alp-BHG system indicated that Alp strongly quenched the intrinsic fl uorescence of BHG causing a conformational change of the protein. The results indicated that the interaction between Alp and BHG was strong, implying that Alp may be stored and transferred by BHG in some degree. In addition, the effects of common ions on the constants of alpinetin-BHG complex were also discussed, indicating an increasing trend for binding constants in the present of different metal ions.

10.7506/spkx1002-6630-201703014

O625

A

1002-6630（2017）03-0081-07

2016-04-04

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31360069）；海南省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（003010151064）；海南省中藥現(xiàn)代化項(xiàng)目（ZY201330）；海南省自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2016CXTD007）

許安琪（1994—），女，學(xué)士，研究方向?yàn)樾》肿优c生物大分子的相互作用。E-mail：749808786@qq.com

*通信作者：何文英（1969—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樾》肿优c生物大分子的相互作用。E-mail：hewenying@hainnu.edu.cn

許安琪, 吳寧寧, 吳雪春, 等. 草豆蔻中的山姜素與血紅蛋白的相互作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(3)： 81-87. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201703014. http：//www.spkx.net.cn

XU Anqi, WU Ningning, WU Xuechun, et al. Interaction of alpinetin from Alpinia katsumadai with hemoglobin[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 81-87. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703014. http：//www.spkx.net.cn

Key words:alpinetin; bovine hemoglobin; energy transfer; interaction