嗜酸乳桿菌胞外蛋白調控MAPK和PI3K-AKT信號途徑關鍵蛋白活化水平

王 泳，賈 彥，任效東，明 珠，江 巖，趙 培?，龐廣昌，閻亞麗，陳慶森?

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

嗜酸乳桿菌胞外蛋白調控MAPK和PI3K-AKT信號途徑關鍵蛋白活化水平

王 泳，賈 彥，任效東，明 珠，江 巖，趙 培?，龐廣昌，閻亞麗，陳慶森?

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

探討并揭示嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CICC6005分泌的相關蛋白質促進腸道健康及分子機制具有重要研究價值。本實驗在確定了L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制HT-29結腸癌細胞增殖的基礎上，進一步探討67 ku和37 ku的胞外蛋白通過何種途徑發揮抑制結腸癌細胞增殖。研究以HT-29細胞作為靶細胞，用絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K-AKT）信號通路為考察對象，以Western Blotting為手段，分析兩個通路中關鍵的靶點蛋白p38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）、磷酸化的細胞外信號調節蛋白激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated AKT，p-AKT）、PI3K的表達水平，以探討并闡述源于L. acidophilus CICC6005胞外蛋白調控結腸癌細胞增殖狀況的分子機制。結果表明，不同質量濃度的67 ku和37 ku胞外蛋白分別作用HT-29細胞一定時間后，兩種胞外蛋白均具有下調兩個信號通路途徑中p-ERK1/2、p-p38、p-AKT、PI3K蛋白的表達，且存在濃度依賴關系；但對p-JNK、ERK1/2、p38、JNK蛋白的表達沒有影響。因此，源于L. acidophilus CICC6005分泌的37 ku和67 ku胞外蛋白表現出顯著的抑制HT-29細胞增殖的功能，其機制可能與調控MAPK和PI3K-AKT兩個信號通路中幾個關鍵的靶點蛋白的活化水平相關。該研究結果提示，食用嗜酸乳桿菌其分泌的胞外蛋白質將達到維護腸道健康的目標。

嗜酸乳桿菌CICC6005；胞外蛋白；HT-29結腸癌細胞；絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）；磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-AKT）

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）天然存在于人和動物的胃腸道和口腔中，有益生保健特性，常與嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌一同用于酸奶的生產[1]。已報道的L. acidophilus生物學功能主要有：耐胃酸和耐膽汁鹽，可順利通過人體胃腸道系統[2]；產VK和乳糖酶，有些菌株能產生細菌素，如：嗜酸乳菌素（acidolin）、乳酸菌素（acidophilin）、乳酸殺菌素（lactocidin），抑制病原菌和腐敗菌的生長，維護腸道健康[3]。美國梅奧診所把L. acidophilus用于心臟病治療，雖尚處于“傳統或科學理論”和“未進行徹底的人體試驗、安全性和有效性尚未證明”階段[4]，但已證實其有改善腸道微生態失衡以及生物拮抗作用[5-6]。近期比較熱門的幾種L. acidophilus菌株的研究，均與人類健康密切相關。美國營養學會上的一篇報道指出酸奶中L. acidophilus L1降低血清膽固醇濃度6%～10%，能有效降低冠心病發病率[7]。L. acidophilus LA-5菌株與腸相關淋巴組織（gutassociated lymphoid tissue，GALT）和脂代謝密切相關，主要表現為增強細胞因子表達、抗體功能以及沙門氏菌吞噬作用、改善及增強腸道菌群多樣性、調節機體免疫力、降低膽固醇水平、緩解乳糖不耐癥、抑制腸黏膜腫瘤細胞的增殖[8-10]。還發現L. acidophilus LA-5能抑制乳腺癌細胞的生長[11]。L. acidophilus NCFM存活于健康和疾病人群的胃腸道系統中，也是常規食品（牛奶、酸奶和嬰幼兒奶粉）和膳食補充劑中常見的益生菌。從表現型和遺傳型上把L. acidophilus NCFM歸為A1型嗜酸乳桿菌菌株[12]。菌株NCFM的功能主要有抑制誘導大鼠異常隱窩的形成、降低了結腸癌發病率、顯著降低小腸細菌過度生長的透析病人血液中毒胺的水平、促進乳糖不耐癥患者對乳糖的消化等。還發現菌株NCFM能在Caco-2和HT-2黏液分泌細胞培養系統中生存，產生抗菌活性物質，能很好的用于遺傳操作和DNA的導入[13]。人們日常消費的L. acidophilus NCFM也有抗炎作用，其能緩解發燒、咳嗽、流鼻涕等癥狀[14-15]。益生菌與人體健康的作用機制尚需更深入研究。

有研究揭示食用經過遺傳改造的L. acidophilus能重置小鼠可能導致癌癥的免疫應答，并縮小前癌結腸息肉[16]。此前已有對腸道微生物L. acidophilus的研究證實，若刪除其脂磷壁酸（lipteihcoicacid，LTA）分子的基因，會降低導致小鼠結腸炎的炎癥應答[17]。為研究LTA是否為促進腫瘤過度活躍的炎癥應答的因素之一，Khazaie等[16]給病理性炎癥和前癌結腸息肉的小鼠口服缺乏LTA的L. acidophilus，結果證實該療法重置了過度活躍的炎癥應答，小鼠的腸內環境恢復到了健康的平衡態；除此，還發現L. acidophilus可能具有調控腸內免疫、逆轉某些前癌狀態及預防諸如結腸癌等炎癥驅動的惡性腫瘤的功能。

已有研究表明，益生菌分泌的一些代謝產物具有免疫調節作用，能夠促進腸道穩態，在保健食品的開發研究中具有顯著的開發潛力[18]。研究結果已經闡述了益生菌的胞外蛋白可以參與調節腸黏膜的免疫機制，包括與定殖在腸道的菌群的“信息交流”、與宿主免疫系統之間的相互作用、調節黏膜屏障功能等，通過這些機制可以促進腸道穩態。胞外蛋白對腸黏膜免疫機制的調節通過可識別胞外蛋白的受體的互作來實現，如Toll樣受體等，通過胞內信號級聯識別胞外蛋白及其攜帶的信息。一般情況下，信號要通過不同的通路途徑進行傳輸，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B，PI3K-AKT）信號通路和糖原合成激酶-3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）信號通路等[19]。這些信號通路途徑的激活會引起下游基因表達的改變，從而細胞水平也隨之發生改變。因此，MAPK和PI3K-AKT信號傳導通路在結直腸癌的發生發展中具有很重要的作用，弄清胞外蛋白作用的信號通路對結腸癌中的作用機制，并且對其靶點（即一些關鍵蛋白）進行早期干預，可以減輕腸道黏膜的損傷，維持腸上皮穩態，防止結腸癌等腸道疾病的發生[20-21]。Schlee等[22]研究發現L. acidophilus PZ 1138、發酵乳桿菌PZ 1162，干酪乳桿菌干酪亞種LMGP-17806混合益生菌分泌的胞外蛋白可以通過激活NF-κB和MAPK信號通路誘導上皮細胞抗菌肽hβD-2的分泌。Bernardo等[23]研究發現植物乳桿菌分泌的肽類物質可以誘導人類腸道樹突細胞產生白細胞介素（interleukin，IL）-10，IL-10對炎癥、自身免疫疾病的預防和腸道穩態的維持有很重要的作用。

近些年來，益生菌分泌的胞外蛋白成為學者們研究的一個新的熱點，相關生理功能的研究已有報道。目前，胞外蛋白可分為兩類，第一類是含有信號肽且位于序列N-末端的蛋白質，第二類是因細菌細胞壁的正常周期從細菌直接脫落的蛋白質。分泌胞外蛋白的益生菌主要有乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌等[24-25]。Yan Fang等[26]采用離子交換法從鼠李糖乳桿菌上清液純化出兩種蛋白質p75、p40，它們通過激活蛋白PI3K-AKT信號通路，從而抑制細胞凋亡和防止小鼠腸上皮細胞的損傷，揭示了p75和p40是一類促生長因子，是維持人類胃腸道穩態重要的分泌蛋白，可以通過特殊的信號通路保護腸黏膜屏障并促進腸上皮穩態。因此，這些研究確認了益生菌分泌的胞外蛋白在腸道黏膜中發揮著很重要的免疫調節作用，為腸道疾病特別是腸道腫瘤的緩解、修復和治療方面開辟一條新途徑。

基于以上研究成果，闡明益生菌分泌的胞外蛋白維持人類胃腸道穩態和保護腸黏膜屏障的機制是一個非常重要的科學問題。本研究將以L. acidophilus CICC6005分離純化的胞外蛋白為研究對象，以人HT-29結腸癌細胞作為模型，通過對MAPK和PI3K-AKT信號傳導通路途徑中關鍵蛋白因子的研究，進一步探討并揭示L. acidophilus CICC6005胞外蛋白抑制結腸癌細胞的分子機制，并為L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白作為抑制、治療結腸癌的生物功能產品的開發提供新依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CICC6005的 67 ku和37 ku胞外蛋白產物，由天津市食品生物技術重點實驗室分離純化獲得[27]。

人結腸癌HT-29細胞購自江蘇齊氏生物科技有限公司。

全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG） 北京康為世紀生物科技有限公司；蛋白預染Marker #0671 立陶宛Fermantas公司；改良型RPMI-1640培養基 美國Hyclone公司；胎牛血清 美國Gibco公司；兔抗人c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）單克隆抗體、兔抗人細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）單克隆抗體、兔抗人p38單克隆抗體、兔抗人磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）單克隆抗體、兔抗人p-JNK單克隆抗體、兔抗人p-ERK單克隆抗體、兔抗人p-AKT單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體 美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人β-肌動蛋白多克隆抗英國Abcam公司；ECL超敏底物化學發光檢測試劑盒美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳槽、DYCZ-40D型迷你轉印電泳槽、DYY-2C型電泳儀 北京六一儀器廠；PVDF膜（0.45 μm） 美國Millipore公司；X射線攝影暗匣（127 mm×178 mm） 廣東粵華醫療器械廠有限公司；X-OMAT型醫用X射線膠片 銳珂（廈門）醫療器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人結腸癌HT-29細胞培養及藥物干預

用于HT-29細胞生長的培養基：10 mL胎牛血清和90 mL改良型RPMI-1640培養基混勻。細胞凍存液：5 mL胎牛血清、改良型4 mL RPMI-1640培養基和1 mL 10%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）混勻。

人結腸癌細胞株HT-29，接種于直徑100 mm培養皿中，貼壁后分組藥物刺激48 h。分組：對照組（只有HT-29細胞）、37 ku胞外蛋白組（HT-29細胞＋37 ku胞外蛋白）、67 ku胞外蛋白組（HT-29細胞＋67 ku胞外蛋白）。兩種胞外蛋白干預劑量的參照文獻[28]，67 ku和37 ku胞外蛋白組劑量均設4 個質量濃度組，分別為0.001、0.010、0.100、1.000 μg/mL。

1.3.2 提取細胞總蛋白

人結腸癌HT-29細胞總蛋白質的提取，按全蛋白抽提試劑盒說明書進行操作。提取蛋白于－80 ℃分裝保存，避免反復凍融。采用二喹啉甲酸法確定總蛋白量，操作按說明書步驟。

1.3.3 Western Blotting

參照文獻[28]的方法。L. acidophilus CICC6005胞外蛋白對MAPK和PI3K-AKT信號通路中p38/p-p38（38 ku）、ERK/p-ERK（42/44 ku）、JNK/p-JNK（46/54 ku）、p-AKT（60 ku）和PI3K（85 ku）的表達水平的檢測分析，其中加樣操作：向細胞總蛋白加入5×蛋白上樣緩沖液，前者與后者體積比4∶1，煮沸變性5 min，冷卻至室溫，用微量加樣器吸取樣品，潛水加樣。檢測蛋白質的轉膜條件如表1。

表1 MAPK和PI3K-AKT信號通路中各檢測蛋白質的轉膜條件Table1 Transmembrane conditions for measured proteins involved in MAPK and PII33KK--AAKKTT signaling pathways

1.4 統計學分析

使用SPSS 17.0統計軟件對實驗數據進行分析處理，進行單因素方差分析，處理結果以±s表示，定義P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 L. acidophilus CICC6005胞外蛋白對HT-29結腸癌細胞MAPK信號通路的影響

根據本研究方案的設計，重點考察L. acidophilus CICC6005胞外蛋白對HT-29結腸癌細胞MAPK信號通路家族中3 個關鍵靶點蛋白（p38、ERK和JNK）活化水平，確定胞外蛋白干預后是否通過調控這幾個關鍵蛋白的活性狀態達到MAPK信號通路的調控，最終闡述胞外蛋白抑制HT-29細胞的增殖的分子水平。

p38是MAPK家族成員之一，當p38受到外界刺激時，其蘇氨酸（Thr180）與酪氨酸（Tyr182）磷酸化同時被激活，激活后的p38 MAPK作用于其下游底物，包括各種轉錄因子等，使其轉錄活性升高，導致疾病的發生。因此有效控制這條信號傳導通路的活性，可達到緩解和治療疾病的作用[29]。ERK1/2通路是MAPK的一個重要信號途徑，在調節細胞的生長、遷移、分化、存活和凋亡中具有重要作用。JNK是MAPK超家族成員之一，特異性刺激因素先引起絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogenactivated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）活化，接下來磷酸化和活化MAPKK的亞型MKK4和MKK7，它們再依次磷酸化和活化JNK[30]，活化后的JNK可以參與下游相關基因表達，從而導致疾病的發生。采用Western Blotting技術檢測各組HT-29細胞p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK蛋白表達量的變化，結果分別如圖1所示，隨后利用Quantity One凝膠成像分析軟件獲得各個條帶的灰度積分值，以β-肌動蛋白作為內參對各目的蛋白進行標準化定量，得到的各組樣品p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK的相對灰度積分值，分別見圖2所示。

圖1 嗜酸乳桿菌胞外蛋白對HT-29細胞各蛋白表達量的影響Fig.1 Effect of extracellular proteins from L. acidophilus on protein expression in HT-29 cells

圖2 不同胞外蛋白質質量濃度作用HT-29細胞對各組蛋白表達量的影響Fig.2 Changes in protein expression in HT-29 cells exposed to different concentrations of extracellular proteins from L. acidophilus

由圖2a可知，不同質量濃度67 ku胞外蛋白作用HT-29細胞48 h，p38蛋白的磷酸化程度隨其質量濃度的增大而逐漸減弱，其中A1組與對照組比較p-p38蛋白的表達抑制較為顯著（P＜0.05），A2、A3、A4組能極顯著降低p38蛋白磷酸化程度（P＜0.01）；p38蛋白的磷酸化程度也隨37 ku胞外蛋白質量濃度的增大而減弱，B1、B2、B3、B4組能顯著抑制p-p38蛋白的表達，其中，B2組、B3組、B4組與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）。由圖2b可知，各組總p38蛋白的表達與對照比較，無顯著性差異（P＞0.05）。由圖2c、d可知，ERK磷酸化程度較對照組都顯著下降，并呈現出劑量依賴性，其中，A1，B1組顯著降低ERK磷酸化的表達（P＜0.05），A2、A3、A4、B2、B3、B4組能極顯著降低ERK磷酸化的表達（P＜0.01）；ERK的表達不隨胞外蛋白質量濃度的變化而改變，即各組ERK蛋白的表達與對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。由圖2e、f可知，各組JNK蛋白表達量與對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。兩種胞外蛋白分別在不同質量濃度條件下處理HT-29細胞48h，JNK的磷酸化程度也不隨胞外蛋白質量濃度的增大而發生改變，各組p-JNK蛋白表達量與對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 L. acidophilus CICC6005胞外蛋白對HT-29結腸癌細胞PI3K-AKT信號通路影響的研究

AKT是細胞通路PI3K-AKT的關鍵分子，在細胞內信號轉導系統中位于PI3K的下游。PI3K是腸上皮細胞增殖信號的一條主要信號途徑。HT-29結腸癌細胞的增殖主要依賴PI3K的活性[31]，因此，抑制PI3K的活性，有利于對結腸癌的緩解和治療。采用Western Blotting技術檢測各組HT-29細胞p-AKT、PI3K蛋白表達量的變化，結果如圖3所示，隨后利用Quantity One凝膠成像分析軟件獲得各個條帶的灰度積分值，以β-肌動蛋白作為內參對p-AKT和PI3K目的蛋白進行標準化定量，得到的各組樣品p-AKT和PI3K蛋白的相對灰度積分值，見圖4所示。

圖3 嗜酸乳桿菌胞外蛋白對HT-29細胞p-AKT（a）、PI3K（bb）蛋白表達量的影響Fig.3 Effect of extracellular proteins from L. acidophilus on the expression of p-AKT (a) and PI3K (b) in HT-29 cells

圖4 不同蛋白質質量濃度對HT-29細胞p-AKT（a）、PI3K（bb）表達量的變化Fig.4 Changes in protein expression of p-AKT (a) and PI3K (b) in HT-29 cells exposed to different concentrations of extracellular proteins from L. acidophilus

由圖4a可以看出，不同質量濃度的兩種胞外蛋白作用HT-29結腸癌細胞后，AKT的磷酸化水平明顯下調，隨著兩種胞外蛋白質量濃度的逐步增高，它們的磷酸化水平的下調都更加明顯，其中A1、B1組與對照組比較無明顯差異（P＞0.05），A2、B2組抑制AKT的磷酸化作用較為顯著（P＜0.05），A3、A4、B3、B4組能極顯著降低AKT磷酸化的表達（P＜0.01）。由圖4b可知，PI3K蛋白的表達水平隨著兩種胞外蛋白質量濃度的增大而降低，其中A1、A2、B1組與對照組比較，PI3K蛋白的表達無顯著差異（P＞0.05），A3、A4、B2、B3、B4組均能極顯著降低PI3K蛋白的表達（P＜0.01）

3 討 論

L. acidophilus是人體腸道中的重要微生物，能改善和調節腸道微生物菌群的平衡，增強機體免疫力，降低膽固醇水平，緩解乳糖不耐癥以及抑制腫瘤細胞的形成等，起到健康促進效果。益生菌的胞外蛋白可以參與調節腸黏膜的免疫機制，包括與宿主免疫系統的作用、調節黏膜屏障功能等，通過這些機制可以促進腸道穩態。胞外蛋白可以作為功能性蛋白用于腸道疾病的生物免疫治療，為解決腸道疾病提供了一條新的有效途徑[32]。已報道研究結論均指向，信號傳導網絡的異常貫穿在結直腸癌等炎癥性疾病的發生發展的各個階段[33]。研究證實，結直腸癌的發生與細胞增殖和凋亡失控有關，通過調控不同信號轉導通路使結腸癌細胞凋亡減少，導致結直腸癌的發生。本實驗室前期的研究已確定L. acidophilus CICC6005分泌的兩種胞外蛋白對HT-29細胞的增殖有明顯抑制作用，并呈劑量和時間依賴關系[34]。

MAPKs是一類細胞內廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，是連接細胞膜表面受體與決定基因表達之間的重要信號調節酶，所以MAPK信號轉導通路是將細胞外信號傳導入胞內的重要信號轉導途徑。目前MAPK家族包括3 個主要成員，分別為p38、ERK1/2，JNK，這些酶激活一些轉錄因子，調控基因表達[35]。

p38是MAPK家族中的重要成員，它是絲氨酸/酪氨酸激酶，當酪氨酸和蘇氨酸磷酸化后，從而激活p38，參與調節細胞的生長、分化、分裂、死亡以及細胞間功能同步，已有許多研究成果進行了報道[36]。蔣莎莉[35]用表沒食子兒茶素沒食子酸酯作用于HT-29細胞的研究表明，該活性成分可能通過抑制p38 MAPK、視網膜細胞瘤蛋白的磷酸化，下調細胞周期蛋白D1、p53、增殖細胞核抗原蛋白表達，誘導HT-29細胞G1期阻滯，抑制HT-29細胞增殖。Miki等[38]發現結腸癌組織中p38 MAPK蛋白呈高表達，并且與增殖及凋亡指數相關。Tang Jun[38]與ONO[39]等研究表明在結腸癌細胞中存在p38γ的mRNA，并發現阻斷了p38γ的表達后，結腸癌細胞惡性程度降低及表型逆轉，由此認為，p38γ與結腸癌發生、發展密切相關。Jin Heiying等[40]應用基因芯片和實時熒光定量PCR技術檢測茶多酚對結腸癌的抑制率及其分子機制，結果提示茶多酚通過抑制p38等基因上調腫瘤抑制率。本課題組前期研究中，利用Western Blotting初步研究了乳源酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）對UC小鼠腸黏膜免疫信號通路（NF-κB和p38 MAPK）的影響，結果表明，乳源CGMP可以顯著抑制抑制NF-κB的激活，CGMP雖然對p38 MAPK的抑制效果不顯著，但仍具有抑制其激活的趨向[41]。本實驗以L. acidophilus CICC6005分泌的兩種胞外蛋白對HT-29結腸癌細胞總蛋白p38和其磷酸化水平進行研究。結果表明，各組p38蛋白的表達量與對照組比較無顯著差異（P＞0.05）；67 ku胞外蛋白處理HT-29細胞48 h，p38蛋白的磷酸化程度隨胞外蛋白質量濃度的增大而逐漸減弱，其中，0.001 μg/mL的67 ku胞外蛋白可顯著降低p38蛋白磷酸化程度（P＜0.05），0.010、0.100、1.000 μg/mL的67 ku胞外蛋白能極顯著抑制p-p38蛋白的表達（P＜0.01），p38蛋白的磷酸化程度也隨著37 ku胞外蛋白質量濃度的增大而減弱，0.001、0.010、0.100、1.000 μg/mL的胞外蛋白質量濃度均能顯著抑制p-p38蛋白的表達（P＜0.05或P＜0.01）。這表明L. acidophilus CICC6005分泌的兩種胞外蛋白可能通過抑制p38蛋白磷酸化程度來調控腫瘤細胞的增殖，并與胞外蛋白對HT-29細胞增殖抑制作用相對同步。

ERK是MAPK三條主要信號傳導通路之一。ERK1和ERK2是ERKs中的兩個重要成員，分子質量分別為44、42 ku。ERK1/2受上游特異性刺激分子MEK1/2雙磷酸化激活，活化的ERK蛋白（p-ERK1/2）形成二聚體，從細胞質移位到細胞核，通過調控一系列轉錄因子而引起細胞增殖分化。p-ERK1/2活性升高可以刺激腸上皮細胞增生與分化，在人結腸癌細胞中可檢測p-ERK表達水平提高。有研究表明，激活的ERK/MAPK信號傳導通路在結腸癌形成、發展的過程中起著十分重要作用[42]。付蕾等[43]研究表明，葉黃素對HT-29結腸癌細胞可以通過下調ERK蛋白的磷酸化水平抑制結腸癌HT-29細胞增殖，并且還可以誘導HT-29細胞凋亡。Bocca等[44]研究發現共軛亞油酸能下調Caco-2細胞中Raf-1的表達水平和ERK1/2的磷酸化水平，并伴隨著下游轉錄因子c-myc的表達減少，以達到抑制結腸癌細胞的增殖的效果。Minelli等[45]在大腸癌的研究中發現，載有醇丁酸酯的固體脂質納米粒能通過下調p-p38及p-ERK的表達，從而抑制大腸癌的轉移。本研究結果表明，67 ku和37 ku胞外蛋白處理后，ERK磷酸化程度較對照組都顯著下降，并呈現出劑量依賴性，其中，0.001 μg/mL的67 ku胞外蛋白和37 ku胞外蛋白能顯著降低ERK磷酸化程度的表達（P＜0.05），其他各組也極顯著降低ERK磷酸化的水平（P＜0.01）。ERK的表達不隨胞外蛋白質量濃度的變化而改變，即各組ERK蛋白的表達與對照組比較無顯著差異（P＞0.05）。許多研究已證實ERK信號轉導通路的異常表達或者異常活化與腫瘤關系密切相關，因此，阻斷該信號途徑的轉導對于結、直腸癌等腫瘤的治療具有重大的意義，本研究結果也證實了這一結論，即L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白可以通過阻斷細胞內ERK信號通路的激活發揮其抑制腫瘤的作用。

JNK是一種能夠特異性磷酸化核內轉錄因子c-Jun的激酶，JNK的直接上游激酶MEK4（MKK4，JNKK1）和MEK7（MKK7，JNKK2）通過雙磷酸化JNK的Thr183和Tyr185位點而激活JNK[46-47]。JNK信號通路的MAPKKK主要有：MEKK1、2、3、4混合連接激酶、凋亡信號調節激酶和TGF-β激活的蛋白激酶[30]。JNK受到上游信號分子的激活后，可使細胞核內轉錄因子c-Jun的氨基末端第63位和第73位絲氨酸殘基被磷酸化，進一步刺激并激活c-Jun，提高其轉錄活性。c-Jun磷酸化后還可以促進c-Jun/c-Fos異二聚體及c-Jun同二聚體的形成，這些轉錄因子能夠結合很多基因啟動子區的轉錄激活蛋白-1位點，以增強其基因的轉錄活性能力[48]。此外，JNK激活之后還可以使轉錄因子Ets-like protein-1和活化轉錄調控因子-2發生磷酸化，并使其轉錄活性增強。本研究結果表明，兩種胞外蛋白分別在不同質量濃度（0.001、0.010、0.100、1.000 μg/mL）條件下處理HT-29細胞48 h，JNK的磷酸化程度也不隨其質量濃度的增大而發生改變，各組p-JNK蛋白水平與對照組比較也無顯著差異（P＞0.05）。雖然并行存在5 條MAPK信號通路，但是到目前為止關于結直腸癌的研究主要集中在ERK1/2和p38信號通路[48]。提示L. acidophilus CICC6005胞外蛋白并沒有通過抑制JNK蛋白磷酸化表達的水平變化來抑制HT-29結腸癌細胞的增殖。

PI3K-AKT信號通路與細胞的增殖、分化、凋亡等細胞反應之間有著密切的聯系。PI3K蛋白具有類酯激酶和蛋白激酶的活性，AKT是PI3K通路中的一個重要的下游激酶，并且具有絲/蘇氨酸激酶活性，當PI3K蛋白激活后，其直接作用AKT蛋白使其發生磷酸化，從而使下游信號通路因子NF-κB抑制蛋白，NF-κB、Bad蛋白、caspase-9、caspase-3等發生磷酸化反應，進而實現其各種生物學作用，比如促進細胞周期進程、抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡[49-51]。PI3K-AKT信號通路中任環節的異常都與結腸直腸癌的發生、發展、治療和預后密切相關。PI3K-AKT信號通路已成為一個新的治療靶點。多種物質在誘導結腸癌細胞凋亡和抑制細胞增殖時，伴有PI3K-AKT信號通路各重要蛋白表達的變化。楊琨等[52]的研究表明，咖啡酸苯乙酯可下調PI3K-AKT信號通路中AKT的磷酸化程度從而上調其信號通路下游因子caspase-3、caspase-9的表達，這種方式可以抑制結腸癌細胞Lovo生長的作用。有研究采用人結腸癌Caco-2細胞為研究對象，使用二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）對其進行干預，結果表明DHA可以通過降低p-AKT蛋白的表達水平抑制Caco-2細胞的增殖，并可以誘導其凋亡，但是DHA作用于正常人結腸細胞NCM460細胞時，表現出抵抗作用[53]。Semba等[54]研究表明LY294002可以誘導結腸癌細胞（DLD-1、LoVo、HCT15和Colo205）凋亡并且抑制其增殖，其分子機制為下調AKT的磷酸化水平，增強caspase-3的活性。但各種細胞對LY294002的敏感性不同，LoVo細胞的敏感性最強。Park等[55]研究表明，利用視黃醇作用人結腸癌細胞HCT116和SW620 30 min后，通過降低PI3K蛋白的活性誘導兩種結腸癌細胞的凋亡，并且研究還發現PI3K蛋白的表達水平與其細胞凋亡呈正相關。王鶴霏等[56]研究顯示，硼替佐米可以抑制結腸癌SW480細胞增殖。其機制可能與抑制人第10號染色體磷酸酶和張力蛋白同源缺失基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）蛋白降解，抑制p-AKT蛋白表達水平有關。本研究結果表明，對于不同質量濃度的67 ku胞外蛋白作用HT-29結腸癌細胞后，AKT的磷酸化水平明顯下調，隨胞外蛋白質量濃度的提高，其磷酸化水平下調更加明顯，其中0.001 μg/mL的67 ku胞外蛋白與對照組比較無明顯差異（P＞0.05），0.010 μg/mL的67 ku胞外蛋白抑制AKT磷酸化較為顯著（P＜0.05），質量濃度為0.100、1.000 μg/mL時均能極顯著降低p-AKT的表達（P＜0.01）；PI3K蛋白的表達量也隨胞外蛋白質量濃度的增大而降低，其中0.001、0.100 μg/mL組與對照組比較，PI3K蛋白的表達無顯著差異（P＞0.05），0.100、1.000 μg/mL組均能極顯著降低PI3K蛋白的表達（P＜0.01）。而對于37 ku的胞外蛋白可顯著下調HT-29結腸癌細胞中p-AKT蛋白表達水平，但其中0.001 μg/mL的37 ku胞外蛋白作用結果與對照組比較無明顯差異（P＞0.0 5），0.0 1 0 μ g/m L的3 7 k u胞外蛋白抑制A K T磷酸化較為顯著（P＜0.0 5），質量濃度0.1 0 0、1.0 0 0 μ g/m L均能極顯著降低AKT的表達（P＜0.01）；PI3K蛋白的表達量也隨胞外蛋白質量濃度的增大而降低，其中0.001 μg/mL組與對照組比較，PI3K蛋白的表達無顯著差異（P＞0.05），0.010、0.100、1.000 μg/mL組均能極顯著降低PI3K蛋白的表達（P＜0.01）。胞外蛋白對HT-29結腸癌細胞PI3K蛋白表達和AKT磷酸化程度呈正相關，PI3K作為AKT的上游激活蛋白，說明胞外蛋白對HT-29結腸癌細胞增殖的抑制作用與PI3K-AKT信號通路有關，蛋白PI3K激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸發生磷酸化形成PIP3，隨后激活下游蛋白AKT，通過這種途徑來調控細胞的增殖和凋亡影響，因此，L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制HT-29細胞增殖的作用機制可能與對PI3K-AKT信號傳導通路的抑制有關。

4 結 論

本研究證實了固態培養L. acidophilus CICC6005分泌的兩種胞外蛋白在一定程度上具有抑制HT-29細胞中MAPK信號通路中相關蛋白質的磷酸化程度，下調p-ERK1/2、p-p38蛋白的表達，但對p-JNK蛋白的表達沒有影響，同時也影響HT-29細胞中PI3K-AKT信號通路相關蛋白的表達，下調p-AKT、PI3K蛋白的表達。研究結果揭示了L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制HT-29結腸癌細胞的分子機制，在促進腸道穩態功效上，可能與MAPK和PI3K-AKT兩個信號通路相關。因此，我們的研究結果闡述了L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制結直腸癌細胞增殖作用的分子機制，也解釋了食用益生菌有助于人類解決結直腸癌的發生和發展問題，該研究結果對人類腸道健康將產生積極的影響。

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Extracellular Proteins from Lactobacillus acidophilus Regulate the Activation of Critical Proteins Involved in the MAPK and PI3K-AKT Signaling Pathways

WANG Yong, JIA Yan, REN Xiaodong, MING Zhu, JIANG Yan, ZHAO Pei?, PANG Guangchang, YAN Yali, CHEN Qingsen?
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Purpose： To explore the role and molecular mechanism of proteins secreted by L. acidophilus CICC6005 in promoting intestinal health and to reveal that this topic is well worth further investigation. Methods： This experiment determined extracellular proteins secreted by L. acidophilus CICC6005 to inhibit the proliferation of HT-29 cells and further explored the pathway by which the extracellular proteins 67 and 37 ku inhibited tumor proliferation. In the present study, HT-29 cells were used as target cells to evaluate the expression levels of the critical target protein p38, c-Jun N-terminal kinase (JNK), c-Jun N-terminal kinase (ERK), phosphorylated p38 (p-p38), phosphorylated c-Jun N-terminal kinase (p-JNK), phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK), phosphorylated protein kinase B (p-AKT), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) in the mitogen activated protein kinase (MAPK) and (phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B) PI3K-AKT signaling pathways through Western blotting in order to explore the molecularmechanism by which that the extracellular proteins from L. acidophilus CICC6005 regulated the proliferation of colon cancer cells. Results： Exposure of HT-29 cells to different concentrations of 67 and 37 ku extracellular proteins from L. acidophilus CICC6005 could significantly inhibit the expression of p-ERK1/2, p-p38, p-AKT and PI3K in a dose-dependent manner for both signaling pathways but not the expression of p-JNK, ERK1/2, p38 and JNK. Conclusion： The extracellular proteins 37 and 67 ku from L. acidophilus CICC6005 could inhibit the proliferation of HT-29 cells, and the mechanism might be related to the activation level of the critical proteins involved in the MAPK and PI3K-AKT pathways. Consumption of extracellular proteins from L. acidophilus could help to maintain intestinal health.

Lactobacillus acidophilus CICC6005; extracellular proteins; colon cancer cell line HT-29; mitogen activated protein kinase (MAPK); phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B (PI3K-AKT)

10.7506/spkx1002-6630-201703026

TS201.3

A

1002-6630（2017）03-0155-09

2016-06-12

國家自然科學基金面上項目（31071522）；天津商業大學國家基金培育項目（160120）

王泳（1993—），女，碩士研究生，研究方向為發酵生物技術、功能成分與腸道健康的關系。E-mail：15620616749@163.com

?通信作者：趙培（1978—）女，副教授，碩士，研究方向為細胞分子生物學，黏膜細胞信號傳導。E-mail：zhaopei@tjcu.edu.cn陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向為發酵生物技術、功能成分與腸道健康的關系。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn

王泳, 賈彥, 任效東, 等. 嗜酸乳桿菌胞外蛋白調控MAPK和PI3K-AKT信號途徑關鍵蛋白活化水平[J]. 食品科學, 2017, 38(3)： 155-163. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703026. http：//www.spkx.net.cn

WANG Yong, JIA Yan, REN Xiaodong, et al. Extracellular proteins from Lactobacillus acidophilus regulate the activation of critical proteins involved in the MAPK and PI3K-AKT signaling pathways[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 155-163. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703026. http：//www.spkx.net.cn