姜黃素抑制Cu2＋誘導的轉APP695基因SH-SY5Y細胞氧化損傷和凋亡作用

鄭博聞，姜招峰，黃漢昌?

（北京聯合大學 生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

姜黃素抑制Cu2＋誘導的轉APP695基因SH-SY5Y細胞氧化損傷和凋亡作用

鄭博聞，姜招峰，黃漢昌?

（北京聯合大學 生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

目的：研究Cu2＋誘導的轉β-淀粉樣前體蛋白（amyloid-β precursor protein，APP）基因SH-SY5Y（SHSY5Y-APP695）細胞氧化損傷、凋亡及姜黃素的抑制作用。方法：在姜黃素預保護和無姜黃素預保護條件下，50 μmol/L Cu2＋處理細胞24 h，測定細胞存活率、胞外乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、胞內活性氧（reactive oxygen，ROS）水平、線粒體膜電位、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3、caspase-8和caspase-9活力，蛋白免疫印跡法測定核轉錄NF-E2相關因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）Ser40位點磷酸化（pSer40-Nrf2）水平以及血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）-1蛋白表達水平。結果：與空白對照相比，Cu2＋損傷組細胞存活率降低，胞內ROS水平和胞外LDH活性升高，線粒體膜電位下降，caspase-9和caspase-3活性明顯升高，pSer40-Nrf2和HO-1含量增加，而姜黃素保護組細胞存活率升高，胞內ROS水平和LDH釋放水平降低，線粒體膜電位恢復升高，caspase-9和caspase-3活性明顯降低，pSer40-Nrf2和HO-1表達量減少。結論：姜黃素在一定程度上減弱了Cu2＋誘導的氧化損傷和細胞凋亡作用。

阿爾茨海默病；Cu2＋；氧化損傷；細胞凋亡；姜黃素；Nrf2/ARE信號通路

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種神經系統退行性疾病，其病理特征主要表現為β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）沉積形 成的老年斑，tau蛋白異常磷酸化形成的神經纖維纏結，以及突觸缺失損傷[1-2]。Aβ是由β-淀粉樣前體蛋白（amyloid-β precursor protein，APP）經β-裂解途徑分泌的含39～43 個氨基酸殘基的多肽。APP基因位于人類第21號染色體長臂上，唐氏綜合癥（Down syndrome）患者體細胞內有3 條21號染色體。AD患者與唐氏綜合癥患者具有很多相似的病理特征表現，包括低的行為認知能力、老年斑沉積和神經纖維纏結等[3]。有報道顯示，在AD患者大腦中APP的mRNA表達水平升高[4]、切割APP產生Aβ的限速酶β-分泌酶蛋白表達水平升高[5]。前期的實驗也表明，在海馬區注射鏈脲佐菌素聯合頸背皮下注射D-半乳糖的AD模型大鼠中海馬區APP表達及Aβ分泌水平升高[6]。這些事實提示大腦衰老退行性病變可能與APP的表達或代謝密切相關，但是，導致APP異常表達和代謝的因素和作用機制還有待進一步地研究。

銅是人體必需的重要微量元素，Cu2＋的穩態失衡會導致疾病的發生[7]。與同年齡對照組相比，AD患者血液中游離Cu2＋水平明顯升高[8]，AD患者腦脊液中的Cu2＋濃度也明顯升高[9-10]。血清中未與銅藍蛋白結合的游離的Cu2＋可能與輕度認知損傷（mild cognitive impairment，MCI）、AD的發展相關，MCI患者中4 a內AD病情發展的概率與血清中游離Cu2＋濃度相關，濃度大于1.6 μmol/L患者的概率是小于1.6 μmol/L患者的3 倍[11]。高濃度的Cu2＋與Aβ結合后可能通過芬頓反應產生活性氧，從而誘導神經元的氧化損傷[12]。因此，Cu2＋穩態失衡可能是AD發生發展的風險因素，維持神經元氧化應激穩態水平可能是AD預防或治療的有效策略。

近來姜黃素在AD預防中的作用和效果受到很多關注[13]。姜黃素可減弱由H2O2導致的SH-SY5Y細胞氧化損傷及細胞凋亡作用[14]。體內實驗表明，姜黃素能夠降低老年鼠腦內氧化產物脂質過氧化產物丙二醛（malonaldehyde，MDA）和核酸氧化產物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）的含量[15]。姜黃素不僅可以使實驗鼠大腦中的淀粉樣蛋白分解，還能預防這種蛋白的生成[16]，另外，姜黃素還能改善AD模型大鼠的行為能力[17]，前期研究表明，適量濃度的姜黃素減弱了Cu2＋誘導的原代培養神經元的氧化損傷[18]，在SH-SY5Y細胞中姜黃素能夠抑制Cu2＋對Nrf2-ARE信號通路的激活作用[19]。本研究以轉染人APP695基因的SH-SY5Y細胞（SH-SY5Y-APP695）為細胞模型，研究姜黃素對Cu2＋誘導細胞損傷和凋亡信號的抑制作用及對Nrf2-ARE信號通路的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5SY-APP695細胞由生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室自行構建，將APP轉錄本NM_201414.2編碼序列構建到慢病毒表達載體、包裝成慢病毒顆粒后感染SH-SY5Y細胞，經篩選后得到穩定表達人APP695的轉基因細胞。

1.2 試劑

姜黃素（≥95% HPLC，生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室自提）臨用時用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO 美國Sigma-aldrich公司）溶解配成20 mmol/L的儲備液。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；細胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）、活性氧檢測試劑盒、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3活性檢測試劑盒、caspase-8活性檢測試劑盒、caspase-9活性檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒 美國Genview公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

從液氮中取出細胞，立刻置于37 ℃水浴鍋中將其迅速解凍，4 ℃、100×g離心5 min；吸去上清液，加入1 mL PRMI 1640培養基清洗，反復3 次，離心條件同上；吸取上清，加入1 mL含血清培養基（PRMI 1640培養基＋10%胎牛血清＋1%鏈霉素-青霉素溶液，100 μg/mL新霉素），均勻接種于培養皿中，每3～4 d傳代1 次。加藥培養時，培養液換成不含血清培養液。實驗分組：空白對照組；姜黃素對照組：10 μmol/L姜黃素孵育細胞24 h；Cu2＋損傷組：50 μmol/L CuCl2孵育細胞24 h；姜黃素保護組1、2、3：分別用1、5、10 μmol/L姜黃素孵育細胞4 h，換液后加入50 μmol/L CuCl2孵育細胞24 h。

1.3.2 CCK-8法測定細胞存活力測定

采用CCK-8法測定細胞存活力，將SH-SY5YAPP695細胞1×104個/孔接種于96 孔板中（細胞懸液100 μL/孔），加藥培養24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37 ℃含5% CO2培養箱中培養4 h。酶標儀測定吸光度，選定波長450 nm（參比波長630 nm），測定每孔的光密度（OD）值。

1.3.3 LDH活力測定

將SH-SY5Y-APP695細胞以1×104個/孔接種于96 孔板中，加藥處理后，按照LDH測定試劑盒測定培養基中的LDH含量。培養基中的LDH是細胞膜損傷的生化指標，可催化培養基中的乳酸和氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD＋）生成丙酮酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）；在堿性條件下產生的丙酮酸將2,4-二硝基苯肼還原成丙酮酸二硝基苯腙，于450 nm波長處測定OD值。

1.3.4 細胞內活性氧水平測定

將SH-SY5Y-APP695細胞以5×105個/孔接種于6 孔板中，藥物處理24 h后吸除培養液，裝載無熒光的二氯二氫熒光素二乙酸酯（dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA）探針（終濃度為10 μmol/L），于細胞培養箱中孵育30 min。該探針可自由透過細胞膜，進入胞內的DCFH-DA可被酯酶水解成二氯二氫熒光素（dichlorodihydro-fluorescein，DCFH），該物質不能自由穿過細胞膜。此時，細胞內的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可使無熒光性的DCFH氧化生成具有熒光性的二氯熒光素（dichloro-fluorescein，DCF），因此胞內DCF的熒光值可反映胞內ROS含量水平。孵育后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 次，加入無酚紅PRMI 1640培養基，于熒光酶標儀測定熒光值（激發波長485 nm，發射波長530 nm）。

1.3.5 線粒體膜電位測定

將SH-SY5Y-APP695細胞以5×105個/孔接種于6 孔板中，藥物處理24 h后吸除培養液加入1 mL無血清培養基和1 mL JC-1染色工作液，充分混勻，于細胞培養箱中37 ℃孵育20 min。孵育結束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2 次，加入2 mL無血清培養液，于熒光酶標儀測定熒光值（單體激發/發射波長：490/530；聚集體激發/發射波長：525/590）。

1.3.6 caspase-3、caspase-8、caspase-9活力測定

將SH-SY5Y-APP695細胞以5×105個/孔接種于6 孔板中，藥物處理24 h后吸除培養液，用冰PBS清洗3 次，加入裂解液收集細胞，于冰上裂解30 min后4 ℃、20 000×g離心13 min。將上清轉移至預冷EP管中，而后按照caspase-3、caspase-8、caspase-9活力測定試劑盒測定其酶活力。

1.3.7 蛋白免疫印跡（Western blot）分析

將SH-SY5Y-APP695細胞以5×105個/孔接種于6 孔板中，藥物處理24 h后收集細胞，每孔加入150 μL含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，將細胞收集至1.5 mL離心管中，冰上裂解30 min；12 000 r/min離心10 min；收集上清液，一部分用BCA法測蛋白濃度，另一部分按V（5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液）：V（樣品）＝1∶4混合處理，100 ℃煮10 min后置于冰上。經過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electropheresis，PAGE）分離不同分子質量的蛋白，電轉膜至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，4 ℃ 條件下一抗過夜；TBST清洗3 次，常溫條件下二抗孵育2 h，TBST清洗3 次后，用增強型化學發光液（enhanced chemiluminescence，ECL）測定蛋白質條帶光密度，并用軟件Quantity One分析條帶灰度值。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 姜黃素對銅離子誘導的細胞形態的影響

圖1 不同處理條件下細胞形態觀察（×4400）Fig.1 Images of cell morphology (×40)

與野生型細胞（圖1A）相比，轉APP基因SH-SY5YAPP695細胞（圖1B）突起變短，胞體增大，有的細胞胞體出現空泡。在10 μmol/L姜黃素孵育下，SH-SY5Y-APP695細胞突起延展較好，胞體較完好，表明姜黃素沒有明顯的細胞損傷作用（圖1C）。經50 μmol/L CuCl2處理24 h后，較多細胞胞體皺縮，突起收縮（圖1D）。首先由姜黃素預保護4 h、再經CuCl2處理24 h后，細胞胞體較為完整，突起延展較為充分（圖1E、F），表明姜黃素在一定程度上減輕了Cu2＋誘導的細胞損傷作用。

2.2 姜黃素對Cu2＋誘導的SH-SY5Y-APP695細胞膜損傷的影響

SH-SY5Y-APP695細胞經50 μmol/L Cu2＋處理后，培養液中LDH活力與對照組相比顯著上升（P＜0.05），表明Cu2＋可造成細胞膜損傷，進而導致胞漿LDH釋放到胞外；與Cu2＋損傷組相比。姜黃素保護組1、2、3（1、5、10 μmol/L姜黃素）LDH活力顯著降低（P＜0.05），這表明姜黃素對SH-SY5Y-APP695細胞預保護后，可減輕Cu2＋對細胞膜的損傷程度（圖2）。

圖2 細胞培養液中的LDH活性（n＝6）6Fig.2 LDH activity in culture medium (n = 6)

2.3 姜黃素對Cu2＋誘導的SH-SY5Y-APP695細胞存活力的影響

與空白對照組相比，SH-SY5Y-APP695細胞經Cu2＋處理后（Cu2＋損傷組），細胞存活力隨Cu2＋濃度升高而顯著下降（P＜0.05）（圖3A）。與Cu2＋損傷組相比，5 μmol/L和10 μmol/L姜黃素保護組細胞存活力顯著升高（P＜0.05）（圖3B）?？梢?，姜黃素在一定濃度條件下能夠提升Cu2＋誘導的SH-SY5Y-APP695細胞存活力。

圖3 細胞相對存活力（n＝66）Fig.3 Relative cell viability (n = 6)

2.4 姜黃素對Cu2＋誘導的SH-SY5Y-APP695細胞內ROS水平的影響

圖4 胞內ROS相對水平（n＝66）Fig.4 Relative intracellular ROS (n = 6)

與空白對照組相比，50 μmol/L Cu2＋損傷組細胞內ROS水平顯著升高（P＜0.05），而5 μmol/L和10 μmol/ L姜黃素保護組與Cu2＋損傷組相比胞內ROS則顯著下降（P＜0.05），說明姜黃素可在一定程度上起到抑制Cu2＋誘導胞內ROS水平升高的作用（圖4）。細胞內ROS主要來源于電子傳遞鏈，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶以及一氧化氮合酶等。

2.5 姜黃素對Cu2＋誘導的線粒體膜電位去極化作用的影響

圖5 細胞線粒體相對膜電位（n＝66）Fig.5 Relative mitochondrial membrane potential (n = 6)

由圖5可知，與空白對照組相比，Cu2＋損傷組細胞線粒體膜電位顯著下降（P＜0.05）；隨著姜黃素濃度升高，線粒體膜電位呈上升趨勢，其中5 μmol/L和10 μmol/L姜黃素保護組相比于Cu2＋損傷組線粒體膜電位顯著升高（P＜0.05），說明姜黃素在一定濃度范圍內起到抑制Cu2＋誘導的SH-SY5Y-APP695細胞線粒體膜電位的去極化作用。

2.6 姜黃素對Cu2＋誘導的SH-SY5Y-APP695細胞caspases活性的影響

圖6 caspases相對活性（n＝66）Fig.6 Relative activity of caspase enzymes (n = 6)

線粒體膜電位下降與細胞凋亡的發生關系密切，線粒體損傷導致細胞色素c等促凋亡因子的釋放，進而激活caspase級聯效應，最終引發細胞凋亡[20]。本研究進一步分析了凋亡相關caspases活性。如圖6所示，與空白對照組相比，Cu2＋損傷組中caspase-3和caspase-9活力上升顯著（約為空白對照組的1.6 倍）（P＜0.05）、caspase-8活力也有一定的升高（約為空白對照組的1.2 倍）（P＜0.05）。與Cu2＋損傷組相比，姜黃素保護組中caspase-3和caspase-9活力均顯著降低（P＜0.05）、caspase-8活力呈現降低的趨勢；姜黃素保護組中，與caspase-8活力相比，caspase-9活力抑制更為明顯。涉及caspase-9的內源性線粒體途徑凋亡和涉及caspase-8的胞表面受體或死亡受體等激活的外源性凋亡是重要的細胞凋亡途徑。本實驗結果說明，姜黃素主要通過抑制線粒體損傷途徑抑制Cu2＋誘導的細胞凋亡。

2.7 姜黃素對Cu2＋誘導的Nrf2-ARE通路激活作用的影響

核轉錄因子NF-E2相關因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是機體內細胞氧化應激反應的關鍵因子，受到胞質接頭蛋白（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）調控，與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）相互作用，進而調節抗氧化酶系和Ⅱ相解毒酶的表達。Nrf2與Keap1的雙甘氨酸重復區 （double glycine repeat，DGR）結合，以復合物形式存在于細胞漿[21]；當細胞受到氧化應激或化學藥物刺激時，胞內產生的親電子化合物等與Keap1的半胱氨酸殘基作用，或在刺激狀態下Nrf2或Keap1發生磷酸化修飾，導致Nrf2與Keap1解離，隨后Nrf2進入細胞核內并與ARE結合，啟動抗氧化相關酶系基因的表達[22-23]。最近研究發現，患有輕度認知障礙患者腦中的外周血單核細胞內，其Nrf2磷酸化水平升高，且大腦皮層細胞核中Nrf2含量增加[24]。Joshi等[25]發現APP/PS1轉基因大鼠敲除Nrf2的基因后，胞內APP水平、Aβ42和Aβ40生成量均有所增加，這些說明細胞內源性Nrf2-ARE抗氧化信號通路可能是AD治療的靶點。本研究進一步探討了Cu2＋對SH-SY5Y-APP695細胞中Nrf2-ARE信號通路的影響及姜黃素的抑制作用。

圖7 pSer40-Nrf2相對表達水平Fig.7 Relative expression level of pSer40-Nrf2

圖8 HO-1蛋白相對表達水平Fig.8 Relative expression level of HO-1

由圖7、8可知，與空白對照組相比，50 μmol/L Cu2＋損傷組顯著增強了pSer40-Nrf表達水平以及HO-1蛋白表達水平（P＜0.05），這說明Cu2＋激活了Nrf2，Nrf2進入細胞核并啟動下游抗氧化酶HO-1等的表達。與Cu2＋損傷組相比，姜黃素保護組顯著降低pSer40-Nrf2表達水平以及HO-1蛋白表達水平（P＜0.05），說明姜黃素抑制了細胞對Cu2＋氧化應激反應，這可能與姜黃素本身具有較強的自由基清除能力有關。

3 結 論

AD患者腦脊液Cu2＋水平明顯高于正常成人，腦中Cu2＋升高導致的氧化應激損傷可能是神經細胞凋亡的原因之一。本實驗結果表明，Cu2＋可在一定程度上引起SH-SY5Y-APP695細胞損傷，導致ROS水平升高、線粒體膜電位發生去極化，增強了caspase-9、caspase-3蛋白酶活性、誘發細胞凋亡。另外，Cu2＋導致細胞自身抗氧化防御系統的激活以抵抗細胞應激水平。姜黃素能夠減弱Cu2＋誘導的氧化損傷和細胞凋亡作用，也在一定程度上減弱了Nrf2/ARE通路的激活作用，即在姜黃素的保護作用下，細胞在一定程度上不必加強過多的Nrf2/ARE防護系統來抵御氧化損傷。

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Inhibitory Effects of Curcumin on Cu2+-Induced Oxidative Damage and Cell Apoptosis in Transgentic APP695SH-SY5Y Cells

ZHENG Bowen, JIANG Zhaofeng, HUANG Hanchang?
(Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective： This study was focused on the protective effect of curcumin on cellular oxidative damage and cell apoptosis induced by Cu2＋in human neuroblastoma SH-SY5Y cells transfected by human amyloid-β precursor protein (APP) (SH-SY5Y-APP695). Methods： SH-SY5Y-APP695cells were treated with 50 μmol/L Cu2＋at 37 ℃ for 24 h with or without curcumin pre-protection. Cell viability was detected by cell counting kit-8 (CCK-8). Extracellular lactate dehydrogenase (LDH), intracellular reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential were determined by commercial assay kits. The enzymatic activities of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 were assessed. Phosphorylation levels of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) at Ser-40 (pSer40-Nrf2) and HO-1 were detected by Western blot analysis. Results： Compared with the control group, Cu2＋administration led to decreased cell viability and mitochondrial membrane potential, increased levels of LDH, intracellular ROS and caspase-3, caspase-8 and caspase-9 activities, and elevated levels of pSer40-Nrf2 and HO-1. Conversely, curcumin increased cell viability and mitochondrial membrane potential, decreased the levels of LDH and intracellular ROS, significantly mitigated caspase-9 and caspase-3 activities, and reduced the expression levels pSer40-Nrf2 and HO-1. Conclusion： Curcumin can attenuate Cu2＋-induced cellular oxidative damage and cell apoptosis.

Alzheimer’s disease; Cu2+; oxidative damage; cell apoptosis; curcumin; Nrf2-antioxidant response element pathway

10.7506/spkx1002-6630-201703027

Q26

A

1002-6630（2017）03-0164-06

2016-03-18

國家自然科學基金面上項目（31471587）；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養計劃項目（CIT&TCD201504034）作者簡介：鄭博聞（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品生物活性物質功能評價。E-mail：tz19901111@163.com

?通信作者：黃漢昌（1975—），男，副教授，博士，研究方向為食品神經分子營養學。E-mail：hanchang@buu.edu.cn

鄭博聞, 姜招峰, 黃漢昌. 姜黃素抑制Cu2＋誘導的轉APP695基因SH-SY5Y細胞氧化損傷和凋亡作用[J]. 食品科學, 2017, 38(3)： 164-169. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703027. http：//www.spkx.net.cn

ZHENG Bowen, JIANG Zhaofeng, HUANG Hanchang. Inhibitory effects of curcumin on Cu2+-induced oxidative damage and cell apoptosis in transgentic APP695SH-SY5Y cells[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 164-169. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703027. http：//www.spkx.net.cn