馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ的抗腫瘤及提高免疫力作用

牛廣財，李世燕，朱 丹，魏文毅，王 贏

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319）

馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ的抗腫瘤及提高免疫力作用

牛廣財1，李世燕1，朱 丹2，魏文毅1，王 贏1

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319）

從馬齒莧中分離純化出2 種多糖組分POPⅡ和POPⅢ，為了解其抗腫瘤及提高免疫力的效果，對在足趾皮下接種荷Lewis肺癌的小鼠腹腔給藥，馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ各分別以50、100 mg/kg（以體質量計）劑量腹腔注射10 d，以環磷酰胺為抗腫瘤陽性對照、云芝糖肽為提高免疫力陽性對照、等體積的生理鹽水為陰性對照進行實驗。結果表明，50、100 mg/kg劑量的馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ對Lewis肺癌荷瘤的抑制率分別為35.10%、41.01%和36.91%、45.11%，兩者與陰性對照之間的差異均達顯著水平（P＜0.05）。免疫實驗表明，馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠自然殺傷（natural killer，NK）細胞毒活性有明顯的激活作用，二者均能顯著提高NK細胞活性，與陰性對照之間的差異均達顯著水平（P＜0.05）。同時，POPⅡ和POPⅢ能促進荷瘤小鼠淋巴細胞的轉化，刺激指數均在1.27～1.33之間，兩者與陰性對照之間的差異均達顯著水平（P＜0.05）。此外，馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ均能提高正常小鼠的胸腺指數和脾指數。因此，馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ具有顯著的抗腫瘤及提高免疫力的功效。

馬齒莧；多糖；抗腫瘤；提高免疫力

多糖是由單糖基通過糖苷鍵連接而成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物。目前，研究發現的具有抗腫瘤活性的多糖主要來自動物、植物和微生物，其免疫增強作用早已為人們所熟知。近年來，越來越多的研究證明，多糖不僅能夠治療多種免疫缺陷病，還能治療對機體具有嚴重損傷的癌癥[1-6]。所以，天然植物中多糖成分的抗腫瘤活性受到了越來越多的關注。

馬齒莧（Portulace oleracea L.）是一種藥食兩用植物，在我國資源儲備極其豐富，其所包含的有效化學成分主要有多糖類[7-8]、黃酮類[9]、生物堿[10-11]以及香豆素類等[12]。與其他植物多糖一樣，馬齒莧多糖具有廣泛的藥理作用，除有提高免疫力、抗衰老、降血糖等作用外，還具有明顯的抗腫瘤作用[13-16]。崔旻等[17]的研究結果表明，馬齒莧多糖可使小鼠的T淋巴細胞數量增加，可抑制肝癌細胞SMMC7721的增加并降低S180荷瘤小鼠腹水瘤的分裂指數；王曉波等[18]的研究也表明馬齒莧多糖對S180荷瘤小鼠有明顯的抑瘤作用；Zhao Rui等[19]的研究結果顯示，馬齒莧多糖能夠增強宮頸癌荷瘤鼠的免疫功能，使荷瘤鼠的腫瘤體積明顯縮小；丁虹等[20]研究發現馬齒莧多糖還能抑制宮頸癌移植瘤的生長。但是，現有文獻中用于抗腫瘤與提高免疫力研究的馬齒莧多糖，多為沒有進行純化的粗多糖，多糖組分不夠明確。為了進一步明確馬齒莧多糖組分對肺癌體內腫瘤的抑制效果，本實驗采用荷Lewis肺癌小鼠體內腫瘤模型，研究馬齒莧多糖組分POPⅡ和POPⅢ的抑瘤率以及對荷Lewis肺癌小鼠的自然殺傷（natural killer，NK）細胞及淋巴細胞轉化的活性；同時研究該多糖組分對正常小鼠免疫器官（脾臟、胸腺）的影響，以期為馬齒莧多糖組分POPⅡ和POPⅢ的抗腫瘤應用提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

小鼠L929培養細胞均由上海醫藥工業研究院藥理室培養及體內傳代維持。

實驗用C57BL/6小鼠由上海醫藥工業研究院動物組供給，合格證號：滬合動證字第11 7號，體質量19～22 g，雌性；昆明種小鼠，體質量20～22 g，雌雄各半，由延邊大學醫學院動物實驗中心提供。

注射用環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX） 上海華聯制藥廠；云芝糖肽（云芝多糖含量41%） 上海中西藥業股份有限公司；吐溫-80（分析純） 上海紫一試劑廠；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、刀豆球蛋白A（Con A） 武漢晟亞生物技術有限公司。

馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ的制備按照參考文獻[21-22]中的方法。其中，POPⅡ中多糖含量為89.6%，屬果膠類多糖，由阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，半乳糖醛酸含量為9.2%。POPⅡ中存在α、β兩種構型，但以β構型居多；POPⅢ中多糖含量為92.5%，具有果膠的顯著特征，其單糖組成為阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸，半乳糖醛酸含量為7.2%。POPⅢ主鏈結構為α-（1→4）連接的多聚半乳糖醛酸。

1.2 儀器與設備

354型多功能酶標儀、317型CO2細胞培養箱 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 POPⅡ和POPⅢ抗Lewis肺癌荷瘤及對免疫力的影響

POPⅡ和POPⅢ參照一般多糖腹腔給藥的劑量，分別設中、低劑量2 個組，分別為100 、50 mg/kg（以體質量計，下同）。腹腔給藥，每天1 次，連續10 d。每只鼠每天注射體積為0.5 mL。陰性對照組給以與實驗組等體積的生理鹽水，給藥方案為腹腔給藥，每天1 次，連續10 d。抗腫瘤陽性對照組小鼠腹腔給藥CTX 30 mg/kg，每天1 次，連續7 d。免疫陽性對照樣品云芝糖肽2 g/kg，灌胃給藥，每天1 次，連續10 d。實驗組及陽性對照組每組8 只小鼠。陰性對照組為2 組重復。灌胃結束后測定小鼠體質量。

1.3.2 足趾接種Lewis肺癌細胞對小鼠的腫瘤抑制率的影響

取生長旺盛的腫瘤，無菌條件下以常規方法制成約1×107個/mL的癌細胞勻漿懸液，以每只0.05 mL的量接種于受體小鼠的右足趾皮下。24 h后隨機分組，每組8只同時按實驗設計方案給藥，10 d后處死各組小鼠截取足趾稱腫瘤質量，按公式（1）計算腫瘤抑制率。

式中：m對照為對照組足趾平均瘤質量/g；m給藥為給藥組足趾平均瘤質量/g；m空白為陰性對照組足趾平均瘤質量/g。

1.3.3 對荷Lewis肺癌小鼠的NK細胞活性的測定

同1.3.2節接種腫瘤，末次給藥后次日解剖各組小鼠，無菌摘取脾臟，制備成單個脾細胞懸液，低滲除去紅細胞，將細胞懸液轉入培養瓶中37 ℃培養1 h后去除貼壁細胞，計數活細胞調整至3×106個/mL，作為效應細胞。靶細胞取體外培養細胞L929常規培養24 h，以培養液調整細胞濃度為1.5×105個/mL，使效應細胞與靶細胞濃度比為20∶1。取96 孔培養板分別加入效應細胞和靶細胞，另設效應組和靶細胞對照組，于37 ℃、5% CO2條件下培養4 h后，加入MTT染色液，再培養2 h后加入消化液2 h后測各孔570 nm波長處OD值，按公式（2）計算NK細胞活性。

式中：OD1為靶細胞對照組OD值；OD2為實驗組OD值；OD3為效應組OD值。

1.3.4 對荷Lewis肺癌小鼠的淋巴細胞增殖的影響

取C57BL/6小鼠，每只小鼠足趾皮下接種無菌制得的Lewis肺癌細胞混懸液0.05 mL（約1×106個腫瘤細胞）。次日隨機分組，按實驗設計方案給藥，末次給藥后次日在無菌條件下取小鼠脾臟，用100 目篩網制成單個脾細胞懸液，用含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養液調節細胞濃度為1×107個/mL，加入96 孔細胞培養板，每孔100 μL，再加入含Con A（5 μg/mL）的培養液100 μL，置于37 ℃、5% CO2條件下培養72 h。輕輕吸取上清液100 μL，加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL。放置37 ℃、5% CO2條件下培養2 h后加入消化液100 μL，再放置至次日測各孔570 nm波長處OD值，按公式（3）計算刺激指數。

1.3.5 POPⅡ和POPⅢ對正常小鼠免疫器官指數的影響

取正常健康小鼠，隨機分為6組，每組12只，稱初始體質量。其中第一組為陰性對照組，第二、三組分別為POPⅡ 50、100 mg/kg劑量組，第四、五組分別為POPⅢ 50、100 mg/kg劑量組，第六組為免疫陽性對照組（云芝糖肽2 g/kg）。免疫陽性對照組和各馬齒莧多糖劑量組每天灌胃多糖生理鹽水溶液0.5 mL，陰性對照組灌服同體積的生理鹽水。連續給藥15 d，末次給藥24 h后，稱終體質量，并迅速解剖小鼠，測每只小鼠脾臟及胸腺質量，并按公式（4）、（3）計算脾指數和胸腺指數。

2 結果與分析

2.1 POPⅡ和POPⅢ的抗腫瘤活性

POPⅡ和POPⅢ各分別以100、50 mg/kg劑量，對荷Lewis肺癌小鼠足趾皮下接種的腫瘤抑制率分別為41.01%、35.10%及45.11%、36.91%（表1、圖1）。與陰性對照組相比，抗腫瘤陽性對照組的荷Lewis肺癌小鼠的瘤質量顯著降低（P＜0.05），其抑瘤率為95.78%，說明CTX能顯著抑制荷Lewis肺癌小鼠瘤體的生長。與陰性對照組相比，POPⅡ和POPⅢ的兩個劑量組均能顯著抑制荷Lewis肺癌小鼠的瘤體增長（P＜0.05），并且兩個樣品的100 mg/kg劑量組均顯示有40%以上的腫瘤抑制劑。但是，兩樣品不同劑量組間無顯著差異（P＞0.05）。與免疫陽性對照組相比，POPⅡ和POPⅢ的兩個劑量組與其無顯著差異（P＞0.05）。說明在本實驗考察的范圍內，POPⅡ和POPⅢ具有顯著的抑制腫瘤活性。

表1 POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠（足趾皮下接種）的影響Table1 Antitumor effect of POPⅡ and POPⅢ on mice with subcutaneous implantation of Lewis lung carcinoma cells

圖1 POPⅡ和POPⅢ對小鼠Lewis肺癌（足趾皮下接種）的療效荷瘤足趾實像照片Fig.1 Effect of POPⅡ and POP Ⅲ on the growth of Lewis lung carcinoma cells subcutaneously implanted into mice

2.2 POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠NK細胞活性的影響

表2 POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠NK細胞活性的影響Table2 Effect of POPⅡ and POPⅢ on NK activity in mice subcutaneously implanted with Lewis lung carcinoma cells

由表2可知，POPⅡ和POPⅢ的兩個劑量組的NK細胞活性間無顯著差異（P＞0.05），與免疫陽性對照組相比，POPⅡ和POPⅢ的兩個劑量組均無顯著差異（P＞0.05）。但是與陰性對照之間的差異均達顯著水平（P＜0.05）。說明馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠自然殺傷細胞活性有明顯的激活作用，促使NK細胞殺傷靶細胞L929的活性增加。

2.3 POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠淋巴細胞轉化活性的影響

表3 POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠淋巴細胞轉化影響Table3 Effect of POPⅡ and POPⅢ on the proliferation of lymphocytes in mice subcutaneously implanted with Lewis lung carcinoma cells

淋巴細胞的分裂增殖能力在一定程度上反映了機體細胞免疫功能的強弱，淋巴細胞轉化實驗是檢測機體免疫功能常用的實驗方法[23]，由表3可知，POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠淋巴細胞的刺激指數在1.27～1.33之間，兩個劑量組間對荷Lewis肺癌小鼠淋巴細胞轉化無顯著差異（P＞0.05），與免疫陽性對照組相比，POPⅡ和POPⅢ的兩個劑量組與其也無差異（P＞0.05）。但是，與陰性對照組相比，則差異達顯著水平（P＜0.05）。說明POPⅡ和POPⅢ能顯著促進荷Lewis肺癌小鼠淋巴細胞的轉化。

2.4 POPⅡ和POPⅢ對正常小鼠免疫器官指數的影響

表4 POPⅡ和POPⅢ對正常小鼠免疫器官指數的影響Table4 Effect of POPⅡ and POPⅢ on immune organ indexes in normal mmiiccee

胸腺和脾臟是動物的重要免疫器官，胸腺指數和脾指數的大小直接反映機體免疫水平的高低。由表4可知，POPⅡ的2 個劑量組間的胸腺指數和脾臟指數無顯著差異（P＞0.05），POPⅢ的2 個劑量組間的胸腺指數和脾指數也無差異（P＞0.05）。但是，在胸腺指數方面，50 mg/kg的POPⅡ顯著低于100 mg/kg的POPⅢ和免疫陽性對照組的胸腺指數（P＜0.05）；而脾指數方面，POPⅡ和POPⅢ的兩2 個劑量組與免疫陽性對照組間無顯著差異（P＞0.05）。另外，除50 mg/kg POPⅡ外，其余各組的胸腺指數和脾指數與陰性對照組之間的差異均達顯著水平（P＜ 0.05）。說明POPⅡ和POPⅢ對胸腺、脾臟等免疫器官具有一定的刺激增生作用。

3 討 論

本實驗結果表明，100 mg/kg劑量組的POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠的腫瘤抑制率分別為41.01%和45.11%，與崔旻等[17]的50 mg/kg預防組馬齒莧多糖的抑制率40.98%、治療組的抑制率52.72%接近，但低于王曉波等[18]研究的馬齒莧多糖對小鼠S180實體瘤的腫瘤抑制率（50 mg/kg和100 mg/kg組的腫瘤抑制率分別為51.45%和64.96%）。而丁虹等[20]的研究結果表明，腹腔注射100、200、400 mg/kg馬齒莧多糖的c57宮頸癌荷瘤小鼠，其低劑量組、中劑量組和高劑量組的瘤體體積及質量均低于對照組（P＜0.05）。趙蕊等[24]的研究顯示200 mg/kg馬齒莧多糖對小鼠U14宮頸癌實體瘤和腹水瘤均存在抑制作用（P＜0.05），腫瘤抑制率分別為43.76%和47.73%。由此可見，馬齒莧多糖不同組分對不同類型腫瘤的抑制率是有差異的，一般認為，抑制率大于30%即可判定其抗腫瘤有效。因受樣品數量的限制，本實驗未進行常規純多糖高劑量組200 mg/kg的療效實驗，有可能使用高劑量時療效還會提高。本實驗中馬齒莧多糖能抑制荷Lewis肺癌荷瘤的增長，且50 mg/kg低劑量組的POPⅡ和POPⅢ已有顯著的抑瘤作用（P＜0.05），這一結果與崔旻等[17]、王曉波等[18]、丁虹等[20]和趙蕊等[24]的研究結果相一致。

多糖的免疫調節作用是目前公認的抗腫瘤作用的主要機制之一，即通過增強機體免疫力達到殺傷腫瘤細胞的目的，對正常細胞無殺傷作用。馬齒莧多糖對腫瘤的抑制作用機制可能是其提高體內的細胞免疫功能的間接作用和誘導腫瘤細胞凋亡的直接作用而發揮抗腫瘤作用[17,24-25]。NK細胞是一種大顆粒淋巴細胞，可識別和殺滅腫瘤細胞、病毒感染細胞和較大的病原體，并能分泌干擾素（interferon，IFN）-γ等可溶性細胞因子，通過活化中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞觸發特異性免疫應答。胸腺對機體免疫功能的建立以及已喪失免疫功能的重建，具有非常重要的作用。它可生成大量的胸腺細胞（原始淋巴細胞），作為T淋巴細胞的后備和補充，一部分胸腺細胞成熟后離開胸腺，經血液到達全身外周淋巴器官，以發揮細胞免疫和輔助B細胞產生抗體。脾臟是體內最大的免疫器官，除對腫瘤細胞、微生物等物質有過濾作用外，還是淋巴細胞居留和增殖的場所以及產生特異性免疫的基地[26]。王曉波等[27]的研究結果顯示，馬齒莧粗多糖能明顯的提高荷瘤小鼠淋巴細胞增值能力（P＜0.05）；趙蕊等[24]的研究結果表明，馬齒莧多糖能降低宮頸癌荷瘤小鼠脾細胞分泌的IL-4和IL-10水平，并能促進IL-2和IFN-γ的分泌，即可增強荷瘤小鼠細胞免疫功能。本實驗結果表明，POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠NK細胞活性與陰性對照組之間的差異均達顯著水平（P＜0.05），POPⅡ和POPⅢ不僅能顯著促進荷Lewis肺癌小鼠淋巴細胞的轉化，還能夠顯著地提高正常小鼠的胸腺指數和脾指數（P＜0.05），說明POPⅡ和POPⅢ能夠增強小鼠機體免疫器官對異物的吞噬能力且能提高腫瘤小鼠的細胞免疫力。這一結果與趙蕊[28]、盧新華[29]、羅強[30]等的研究結果一致。總之，馬齒莧作為一種食用和藥用價值都很高的草本植物，其多糖在抗腫瘤和提高免疫力等方面的顯著作用，將有助于癌癥的預防與治療，具有非常重要的開發價值。

4 結 論

POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠足趾皮下接種小鼠有顯著的抑瘤效果，POPⅡ和POPⅢ的2個劑量組與陰性對照組之間的差異均達顯著水平（P＜0.05）。表明POPⅡ和POPⅢ具有顯著的抗腫瘤效果。免疫實驗表明，POPⅡ和POPⅢ對荷Lewis肺癌小鼠NK細胞毒活性有明顯的激活作用，二者均能顯著提高NK細胞活性，與陰性對照組之間的差異均達顯著水平（P＜0.05）；POPⅡ和POPⅢ能促進荷瘤小鼠淋巴細胞的轉化，與陰性對照之間的差異均達顯著水平（P＜0.05）；同時，POPⅡ和POPⅢ對胸腺、脾臟等免疫器官具有一定的刺激增生作用。表明馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ具有顯著提高機體免疫力的作用。

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Antitumor and Immunoenhancing Effects of Polysaccharides POP II and POP III from Portulace oleracea L.

NIU Guangcai1, LI Shiyan1, ZHU Dan2, WEI Wenyi1, WANG Ying1
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. College of Life Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

The aim of the present study was to examine the antitumor and immunoenhancing effects of two polysaccharides (POP II and POP III) isolated and purified from Portulace oleracea L. in Lewis lung tumor-bearing mice. The mice subcutaneously implanted with Lewis lung tumor cells on their toes were intraperitoneally injected with each polysaccharide at doses of 100 and 50 mg/kg (body weight) for 10 days, respectively. Meanwhile, cyclophosphamide (CTX) was used as antitumor positive control, and Coriolus versicolor polysaccharopeptide was used as immunoenhancing positive control, and the same volume of normal saline was used as negative control. The results showed that the tumor growth inhibition rates of POP II were 35.10% and 41.01%, while those of POP III were 36.91% and 45.11% at the low and high doses, respectively. Both treatment groups were significantly different from the negative control (P ＜ 0.05). Moreover, POP II and POP III exhibited a stimulating effect on the cytotoxicity of natural killer (NK) cells with a signif i cant difference when compared with the negative control (P ＜ 0.05). Meanwhile, both of them could accelerate the conversion of lymphocytes with a stimulation index of 1.27-1.33, showing signif i cant differences when compared with the negative control (P ＜ 0.05). In a word, POP II and POP III can improve thymus index and spleen index in normal mice and thus play a signif i cant role in antitumor and immunoenhancing functions.

Portulace oleracea L.; polysaccharide; antitumor; immunoenhancing

10.7506/spkx1002-6630-201703033

R967

A

1002-6630（2017）03-0201-05

牛廣財, 李世燕, 朱丹, 等. 馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ的抗腫瘤及提高免疫力作用[J]. 食品科學, 2017, 38(3)： 201-205. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703033. http：//www.spkx.net.cn

NIU Guangcai, LI Shiyan, ZHU Dan, et al. Antitumor and immunoenhancing effects of polysaccharides POP II and POP III from Portulace oleracea L.[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 201-205. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703033. http：//www.spkx.net.cn

2016-06-11

黑龍江八一農墾大學出國留學基金資助項目（BYND2014-X5）

牛廣財（1971—），男，教授，博士，研究方向為食品精深加工。E-mail：gcniu@126.com