乳桿菌噬菌體基因組學研究進展

劉 穎，習 羽，范夢茹，汪政煜，吳文茹，張和平，陳 霞*

（內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

乳桿菌噬菌體基因組學研究進展

劉 穎，習 羽，范夢茹，汪政煜，吳文茹，張和平，陳 霞*

（內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

隨著乳桿菌在乳品工業中的廣泛應用，噬菌體污染對終產品造成的嚴重威脅日益增加。目前，噬菌體相關研究已從最初的形態學進入到了分子水平。許多噬菌體的全基因組測序工作已經完成。基因組研究有助于揭示噬菌體侵染宿主的機制，能挖掘其關鍵功能基因。本文基于乳桿菌噬菌體的基因組信息對主要乳桿菌噬菌體基因組的特征、功能基因組及比較基因組進行了分析和概述，為進一步研究噬菌體提供理論依據。

乳桿菌；噬菌體；基因組

噬菌體是細菌病毒，由于細菌分布廣泛，其噬菌體在自然界中也是一種普遍存在的生物實體。乳桿菌廣泛分布于自然界中，按照伯杰氏細菌學手冊中的生化分類法，乳桿菌的生理生化特性為：革蘭氏染色陽性、無芽孢，能分解糖產生乳酸，作為益生菌的主要成員。常見的乳桿菌包括德氏乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發酵乳桿菌和瑞士乳桿菌等[1]。

眾所周知，發酵乳制品的生產和感官特性依賴于發酵劑菌株的穩定性。發酵劑菌株一旦受到噬菌體侵染，則可能推遲發酵過程，改變產品質量，甚至導致發酵失敗。因此，噬菌體侵染成為了乳品發酵業不可避免的問題。此外，隨著益生菌市場份額的日益增加，噬菌體侵染益生菌也成為益生菌生產中重點關注的問題。另外，在乳酸菌的許多種屬中，溶源現象普遍存在。目前，已有研究證明從溶源菌株中釋放的噬菌體可能是乳品發酵中烈性噬菌體的主要來源之一[2]。因此，了解相關噬菌體生態學、系統發育學和基因組學知識，有利于分析噬菌體與宿主的相互作用，選育抗性菌株，提高發酵穩定性。

1 乳桿菌噬菌體基因組研究概況

由于噬菌體基因組較小、易測序，噬菌體基因組序列信息近10 年呈大幅增長趨勢。在乳酸菌噬菌體全基因組序列中乳球菌序列占絕大多數，而乳桿菌噬菌體全基因組序列信息較為有限。乳桿菌作為乳酸菌1 種，其噬菌體基因組均為雙鏈線性DNA分子。目前，已完成全基因組測序的乳桿菌噬菌體增至30 個左右，其GC含量變化范圍從37%（植物乳桿菌噬菌體LP65）至48%（植物乳桿菌噬菌體LL-H），接近寄主菌的GC含量（32.9%～49.7%）[3]，由此可以看出噬菌體與寄主間的關系密切。乳桿菌噬菌體基因組一般為30～50 kb，但個別較大。由表1可知，噬菌體Ld1基因組為74.81 kb；植物乳桿菌噬菌體LP65基因組為131.521 kb；副干酪乳桿菌噬菌體Lb338-1基因組為142.11 kb。

表1 乳桿菌噬菌體全基因組序列Table1 Complete genomic sequences of Lactobaciilllluuss phaaggeess

由表1可知，已完成全基因組測序的乳桿菌噬菌體數量增加。CL1、CL2、iLp84、iLp1308和iA2等全基因組信息是在近幾年公布的[6]。上述噬菌體均分離自副干酪乳桿菌，對其最初的研究僅局限在生物學特性方面[6,29]。2010年，Capra等[29]對3 個副干酪乳桿菌溫和噬菌體iA2、CL1和CL2的特征進行表述，未對其分子特性進行研究。直至2015年，Mercanti等[6]才分析了5 個副干酪乳桿菌噬菌體（CL1、CL2、iLp84、iLp1308、iA2）的全基因組序列。研究表明這些噬菌體基因組大小為34 155（iA2）～39 474 bp（CL1），GC含量為44.8%～45.6%。此外，Mercanti等[6]指出了副干酪乳桿菌噬菌體的多樣性差異，提出噬菌體和其宿主間常常發生DNA交換。

2 主要乳桿菌噬菌體基因組學

2.1 德氏乳桿菌噬菌體基因組特征

德氏乳桿菌作為發酵劑普遍應用在發酵乳制品生產中以完成產品發酵，提高終產品感官特性[30]。基于DNA同源性，通過基因雜交及比較基因組分析將德氏乳桿菌噬菌體分成5 個類群（a、b、c、d、e）[8]。對a和c組德氏乳桿菌噬菌體研究最為廣泛。a組噬菌體LL-H最初于1972年被分離[31]，其全基因組序列和2 個不同轉錄階段的轉錄圖譜已被確定[27]。同樣，扁平頭部的溫和噬菌體JCL1032是c組德氏乳桿菌噬菌體的代表成員，該噬菌體已經過系統的研究，包括基因組測序[10]、基因的整合分析[32]和作為其受體的磷壁酸的識別[33]。

隨著分離頻率明顯增加，近期研究主要集中在b組噬菌體，如結構蛋白已確定的噬菌體Ld3、Ld17、Ld25A[9]，而d組噬菌體仍處于被廣泛研究階段。Casey等[8]對噬菌體Ldl1的基因組和蛋白質組特征論證后，發現該噬菌體不屬于已確定的德氏乳桿菌噬菌體組中任何一類，通過創建蛋白質樹，將其歸為新組即e組中，成為迄今為止該組的唯一成員。Ld1基因組為74 806 bp，有79 個ORF，GC含量為37.8%，具有與植物乳桿菌噬菌體B2和Sha1較為密切的關系，表明Ldl1也許與B2、Sha1具有共同宿主。

分離于乳清中的保加利亞乳桿菌噬菌體Ld17基因組為32 975 bp，GC含量為41.97%，有50 個ORF，與Ld3和Ld25A有97%和95%的序列一致性，并與噬菌體c5、LL-Ku和phiLdb基因組有高度序列一致性[12]。b組噬菌體大部分結構模塊間是高度保守的，而Ld17在編碼產物ORF19Ld17和ORF20Ld17所代表的區域表現出與同組其他噬菌體顯著的差異。ORF19Ld17編碼產物，包含一個蛋白三聯體重復單元（G-X-Y）16和重復7 次的氨基酸三聯體甘氨酸-天冬氨-賴氨酸。研究表明該重復序列可促進糖蛋白的結合[34]。ORF20Ld17編碼ClpP蛋白酶。噬菌體頭部蛋白比預計分子質量低，可能由ClpP蛋白酶翻譯后的修飾作用引起的[9]。

2.2 發酵乳桿菌噬菌體基因組特征

發酵乳桿菌是專性異型發酵乳酸菌，參與很多傳統食品的自然發酵[35]。大多數菌株能產生細菌素并利用一些難消化的糖類，發揮某些益生特性[36]。

發酵乳桿菌YB5是分離自中國酸奶，產細菌素的耐酸菌株[37]。Zhang Xiuhong等[38]經絲裂霉素誘導獲得其溫和長尾噬菌體ФPYB5，有一個pac-型包裝機制。該報道指出該噬菌體基因組為32 847 bp，GC含量為45.21%，其序列含有46 個ORFs其中25 個有確定功能。基因orf15～orf18編碼產物分別為1 個細胞壁水解酶、2 個葡聚糖酶和1 個脂解蛋白，序列分析發現其與噬菌體—宿主相互作用是相關的，能在噬菌體吸附和侵入過程中發揮作用。噬菌體ФPYB5編碼一個由穴蛋白和細胞溶解酶組成的獨特裂解盒[2]。通常情況下，宿主細胞裂解依賴穴蛋白和細胞溶解酶作用，穴蛋白在細菌細胞膜上引起小孔，通過該小孔細胞溶解酶傳到胞壁質層。許多噬菌體典型穴蛋白有2 個或3 個跨膜轉運區域[39]。ФPYB5的穴蛋白只有一個跨膜區，并且在不存在穴蛋白情況下，細胞溶解酶的表達可能引起宿主細胞裂解[12]。以上研究暗示了細胞溶解酶有著一個特殊的輸出機制，但具體機理仍需進一步分析[2]。

溫和噬菌體LF1是從野生型發酵乳桿菌經絲裂霉素誘導獲得的[16]，透射電子顯微鏡形態分析顯示，LF1有等距的頭部和不能收縮的尾部，屬于長尾噬菌體科。Yoon等[16]并對其基因組進行研究，測序結果表明LF1含有1 條42 606 bp的雙鏈DNA，GC含量為45%，有57 個ORF。同源性分析表明其全基因組序列與噬菌體ФPYB5的核苷酸同源性為28%[2,38]。

2.3 干酪乳桿菌噬菌體基因組特征

侵染干酪乳桿菌的第一個噬菌體分離于日本[40]。最早研究的干酪乳桿菌噬菌體基因組是A2。這個長尾溫和噬菌體能整合其基因組到干酪乳桿菌ATCC 27092中[41]。在基因組初端轉錄區域，有2 個啟動子已被確定，其中啟動子PL指導基因cI的表達（裂解循環阻遏物，lytic cycle repressor），啟動子PR調停裂解功能和cro溶原阻遏物基因的轉錄[42-44]。噬菌體結合位點在裂解和溶原模塊之間，接近編碼整合酶基因orf20[45]。該噬菌體基因組存在2 個－1核糖體移碼翻譯[33,46]，分別產生了主要衣殼蛋白和尾部蛋白[47-48]。

噬菌體J-1是從益力多異常發酵產物中分離得到的，在抗噬菌體J-1的菌株用于飲料生產2 a后，噬菌體PL-1被分離[49]。起初日本研究組對該噬菌體做了大量研究，包括噬菌體形態，失活，細胞吸附，DNA注入和分解酶特性等[50-53]。Dieterle等[13,54]對噬菌體J-1和PL-1基因組序列和功能進行了闡述，噬菌體J-1的DNA長40 931 bp，噬菌體PL-1的DNA長38 880 bp。GC含量分別是44.8%和44.9%。2 個噬菌體均有含10 個堿基的獨特黏性末端，該黏性末端是單鏈的3’延長物（左端末尾為3’-CGGTCGGCCT），比之前Nakashima等[55]所描述的序列GAACGGTCGGCCTC短4 個堿基對。J-1基因組中含有63 個ORF，不含有tRNA基因。J-1和PL-1的基因產物gp16識別糖結構，可結合到干酪乳桿菌細胞中，這暗示著gp16與宿主識別相關。此外，研究者還發現L-鼠李糖的加入可以抑制兩者間的結合及噬菌體對細胞壁的吸附作用[54]。

2.4 植物乳桿菌噬菌體基因組特征

目前，已有6 株植物乳桿菌噬菌體基因組完成測序[14,15,20,21,56]。從植物原料中分離噬菌體phigle的基因組大小為42 259 bp，包含62 個ORF[21]。分離自朝鮮泡菜的噬菌體Sha1基因組為大小為41 726 bp，GC含量為40.6%[15]。分離自發酵黃瓜的噬菌體phiJL-1基因組大小為36 674 bp，GC含量為39.4%及52 個ORF[17]。分離自發酵肉的噬菌體LP65的基因組較大，為13 1573 bp，其GC含量為37.7%，有165 個ORF[20]。Marcó等[14]對分離自青貯玉米和厭氧污泥中的2 個植物乳桿菌烈性長尾噬菌體ATCC 8014-B1（B1）和ATCC 8014-B2（B2）的基因組進行了研究，研究發現，pac-型噬菌體B1的線性雙鏈DNA基因組有38 002 bp，GC含量為47.6%，含有60 個ORF，覆蓋基因組長度的93%。噬菌體B1基因組和植物乳桿菌噬菌體JL-1有77%的同源性。cos-型噬菌體B2雙鏈DNA基因組大小為80 618 bp，GC含量為36.9%，含有127 個ORF，覆蓋基因組長度的87%。噬菌體B2的GC含量較低，與植物乳桿菌肌尾噬菌體LP65的GC含量相似[20]。在噬菌體B2中發現6 個tRNAs，但在B1中沒有。該6 個tRNAs位于B2基因組中的2 個區域（6 246～7 814 nt和42 308～42 522 nt），編碼產生天冬酰胺、亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸和精氨酸。tRNA的存在與噬菌體較大基因組聯系在一起的[56]。噬菌體B1基因組中沒有發現溶原相關基因，證實了其烈性本質。噬菌體B2中發現少數與前噬菌體相關的蛋白質（Orf39、Orf43和Orf105），但噬菌體B2表現出烈性噬菌體的生長特性。

2.5 瑞士乳桿菌噬菌體基因組特征

Zago等[23]對瑞氏乳桿菌噬菌體ΦAQ113的基因組特性進行了研究。研究表明，該噬菌體的線型環狀雙鏈DNA基因組為36 566 bp，GC含量為37%。在瑞氏乳桿菌噬菌體ΦAQ113基因組中不存在黏性末端，DNA連接未能改變限制性圖譜，并提出ΦAQ113可利用pac-DNA包裝機制的假設。該噬菌體基因組大小與烈性長尾植物乳桿菌噬菌體ФphiJL-1、鼠李糖乳桿菌噬菌體ΦLc-Nu和溫和肌尾格氏乳桿菌噬菌體ΦKC5a相似[12]。GC含量類似于格氏乳桿菌噬菌體Φadh[57]。56 個ORF中約有90%被確定具有假定功能（DNA復制/修飾、DNA包裝、頭部及尾部形態形成等）。與此同時該研究小組發現ΦAQ113基因組與加氏乳桿菌噬菌體KC5a和約氏乳桿菌噬菌體Lj771基因組關系密切，尤其在包裝及尾部和頭部形態發生的基因模塊排列上與加氏乳桿菌和約氏乳桿菌噬菌體相似。ΦAQ113和這2 個噬菌體間的進化相似性證實了它們可能來自于一個共同的祖先[23]。

3 乳桿菌噬菌體功能基因組學

繼乳桿菌噬菌體基因組測序完成后，利用基因組結構所提供的信息及同源性比較，可預測ORF的功能[58]。基因組研究已確定了大量重要噬菌體侵染相關基因。研究表明[2,7.8,14,15,24,54]，噬菌體基因組是高度模塊化的，功能基因共同聚集在基因組結構中，并在協調中被開啟和關閉，基因組可能包括以下功能模塊：DNA包裝、形態發生、細胞裂解與溶原模塊及DNA復制模塊，其中一些ORF編碼蛋白在噬菌體侵染過程中至關重要，如溶菌酶、轉錄調控因子、抗阻遏物、受體結合蛋白、DNA甲基化酶、毒素組分、末端酶亞基、細胞壁水解酶和尾部卷曲蛋白等。噬菌體ΦAQ113基因組中，ORF1、3、4的基因產物是噬菌體末端酶的大小亞基，與加氏乳桿菌噬菌體ФKC5a中的相似度在66%～83%間。表明這3 個蛋白質參與噬菌體DNA包裝。ORF35編碼蛋白顯示出屬于裂解模塊基因的相似基因[23]，與瑞士乳桿菌溫和噬菌體Φ-0303的細胞內溶素Mur-LH具有高度一致性（88%）[59]，并在其他瑞士乳桿菌噬菌體中也被檢測到，同源性達99%[60]。溫和噬菌體LBR48全基因組序列分析顯示尾部蛋白質基因不是長的，與許多乳品噬菌體尾部形態形成模塊不同，編碼一個很長的多區域蛋白質[61]。該尾絲是缺失的，與透射電子顯微鏡觀察相一致[7]。噬菌體Ldl1中ORF23Ldl1編碼的尾部卷曲蛋白（tape measure protein，TMP）包含結合肽聚糖的LysM（lysin motif）區域[62]和催化肽聚糖水解的轉糖苷酶區域，這2 個區域暗示出噬菌體侵染過程中TMP發揮重要及多功能作用并決定噬菌體尾部長度。Ldl1包含溶原性遺傳因子和一個重組酶/整合酶基因，然而即使有溶原性ORF存在，Ldl1也未表現溶原特性，表明它也許是從溶原性噬菌體進化的[8]。

噬菌體侵染周期的第一步是噬菌體吸附，吸附專一性取決于宿主菌株表面組分和噬菌體組分，受體和反受體。吸附第一階段是受體結合蛋白識別受體結合部位，該結合是可逆的，因此不能保證成功的噬菌體侵染；在第二階段，由于細菌與噬菌體表面蛋白質的不可逆結合，噬菌體牢固地附著在細菌細胞上[63-64]。基因組研究揭示了噬菌體編碼受體結合蛋白的基因，如噬菌體Ldl1基因組中存在2 個可能的宿主識別蛋白基因ORF26Ldl1和ORF27Ldl1[8]。在革蘭氏陽性菌中，肽聚糖、磷壁酸、脂磷壁酸和細胞膜相關蛋白已被報道為噬菌體受體分子[33,65]。Munsch-Alatossava等[66]提出并討論了噬菌體LL-H侵染乳酸乳桿菌ATCC 15808過程中相關的胞外噬菌體-宿主相互作用模型，即在噬菌體侵染的胞外階段，LL-H的反受體-乳酸乳桿菌ATCC 15808的脂磷壁酸相互作用模型并闡述德氏乳桿菌脂磷壁酸的結構和噬菌體受體性質，表明特有基因改變如影響噬菌體受體分子結構的自發突變可能阻止特定噬菌體吸附從而增加突變菌株對噬菌體的抗性。另外噬菌體與宿主菌的共同進化可促進突變發生，并且反受體基因突變可能改變這些突變噬菌體的宿主范圍。對噬菌體建立緊密聯系后，噬菌體將遺傳物質注入細菌細胞質中，衣殼留在細胞外[67]。烈性噬菌體通過改變宿主復制機制和代謝功能來復制自身的遺傳物質并合成噬菌體編碼蛋白質，產出豐富的子代噬菌體。然而某些溫和噬菌體在宿主中以休眠狀態進入溶原性生命周期[63]。

4 比較基因組分析

部分乳桿菌噬菌體全基因組測序的完成，為不同乳桿菌噬菌體間全基因組比較提供了基礎。通過不同乳桿菌噬菌體種間（或種內）的比較基因組學，發現不同種（或種內不同類型）乳桿菌噬菌體在基因組結構上的差異、獲得噬菌體進化的相關信息[68]。目前，比較基因組分析主要集中在長尾噬菌體，因為僅有7 個肌尾噬菌體的全基因組是可獲得的[5,7,20,22-23,25]。

Riipinen等[10]對德氏乳桿菌噬菌體LL-Ku、c5、JCL1032的基因組序列進行了比較分析，得出同屬于b組噬菌體LL-Ku和c5的基因組顯示較高的核苷酸序列同源性。噬菌體LL-Ku和c5在時間和空間上是相隔孤立的，但基因組間是高度保守的。1950年早期，cos型乳酸乳桿菌噬菌體LL-Ku分離自芬蘭奶酪廠的乳清樣品中[69]。酸奶中產生的cos型保加利亞乳桿菌烈性噬菌體c5于1963年在法國被分離得到[70]。LL-Ku和c5蛋白質組和基因組結構幾乎是相同的，除DNA包裝模塊（g1c5/g2c5和g4LL-Ku）和復制模塊（g34c5）中3 個大小為859、678、470 bp的插入和缺失。比較序列分析表明插入、缺失和重組在LL-Ku和c5的多樣性中發揮了重要作用。點突變和小的插入和缺失會進一步導致噬菌體的遺傳變異。JCL1032作為c組中的溫和噬菌體，其基因組包含功能性溶原模塊、2組Ⅰ型內含子和尾部模塊，基因組遠大于噬菌體LL-Ku和c5，且與LL-Ku和c5顯示出較低的DNA同源性[10]。Dieterle等[54]對分離自同一株干酪乳桿菌的噬菌體PL-1和J-1進行基因組比較分析，數據表明這兩個噬菌體基因組幾乎是相同的，但與J-1相比，PL-1在基因切換區域有一個與免疫相關的大小為1.9 kb基因缺失，編碼特定尾部蛋白的基因也有所不同。和其他乳酸菌噬菌體核苷酸序列相比，噬菌體PL-1和J-1與噬菌體A2在包裝和結構基因方面密切相關[71]。根據BLAST分析，發酵乳桿菌噬菌體LF1和ФPYB5的核苷酸一致性為28%[2,16]，包裝和結構模塊的基因同源性較高。兩者DNA包裝區域的序列相似為93%，因此LF1和ФPYB5的基因組間有良好的基因鑲嵌關系[2]。

5 結 語

目前，研究領域對乳桿菌噬菌體研究取得了重大進步，但仍滯后于其他噬菌體的研究。且國內對乳桿菌噬菌體研究很少，這方面亟待加強。乳桿菌噬菌體分子水平上的研究揭示了其多樣性和進化規律，根據基因組特點對乳桿菌噬菌體重新進行了分類及界定。隨著益生乳桿菌產品的增加，噬菌體相關的發酵、生產困難在未來將會增加。對新型噬菌體的特性進行詳細闡明，包括它們的起源、進化及與其他噬菌體的關系，都需以噬菌體全基因組為基礎。乳桿菌噬菌體的全基因組測序，為深入挖掘功能基因明確基因表達特點及系統闡述噬菌體增殖機制提供一種有效的研究手段。另外采用現代生物技術對宿主菌株進行基因改造這可阻斷噬菌體對宿主菌的裂解作用，從而選育出抗噬菌體菌株，對有效預防噬菌體污染具有重要意義。

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Advances in Genomic Studies of Lactobacillus Phages

LIU Ying, XI Yu, FAN Mengru, WANG Zhengyu, WU Wenru, ZHANG Heping, CHEN Xia*
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Ministry of Education, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

With the extensive application of Lactobacilli for the dairy industry, phage contamination has posed an increasingly serious threat to the final products. Currently, phage research has evolved from the morphological to the molecular level. The full-length genomic sequences of many phages have been acquired. Genomic studies have contributed to revealing the infective mechanisms of phages and in turn exploring the key functional genes. In this paper, the genomic characteristics, functio nal genomics and comparative genomics of the major Lactobacillus phages published were analyzed, aiming to provide a theoretical basis for further exploration of phages.

Lactobacillus; phage; genomics

10.7506/spkx1002-6630-201703043

Q754

A

1002-6630（2017）03-0271-07

劉穎, 習羽, 范夢茹, 等. 乳桿菌噬菌體基因組學研究進展[J]. 食品科學, 2017, 38(3)： 271-277. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703043. http：//www.spkx.net.cn

LIU Ying, XI Yu, FAN Mengru, et al. Advances in genomic studies of Lactobacillus phages[J]. Food Science, 2017, 38(3)：271-277. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703043. http：//www.spkx.net.cn

2016-03-18

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301517）；內蒙古自治區自然科學基金面上項目（2013MS1207）

劉穎（1993—），女，碩士研究生，研究方向為乳品生物技術。E-mail：932845217@qq.com

*通信作者：陳霞（1982—），女，副教授，博士，研究方向為乳品生物技術。E-mail：chenxia8280@163.com