蕎麥脫落酸不敏感基因序列分析

汪 燕，劉 瑤，梁成剛，*，陳晴晴，石桃雄，陳其皎，孟子燁，陳慶富

(1.貴州師范大學 蕎麥產業技術研究中心，貴州 貴陽550001； 2.陜西米倉山國家級自然保護區管理局，陜西 漢中 723500)

蕎麥脫落酸不敏感基因序列分析

汪 燕1，劉 瑤2，梁成剛1，*，陳晴晴1，石桃雄1，陳其皎1，孟子燁1，陳慶富1

(1.貴州師范大學 蕎麥產業技術研究中心，貴州 貴陽550001； 2.陜西米倉山國家級自然保護區管理局，陜西 漢中 723500)

脫落酸不敏感基因(ABA-insensitive， ABI)是調控植物逆境脅迫應答、種子脫落和休眠等的一類轉錄因子。生物信息學分析發現，普通蕎麥ABI(CL38501)基因cDNA全長為963 bp，編碼320個氨基酸，含有典型的bZIP結構域和ABI5家族保守區Ⅱ，推測該基因可能編碼ABI5家族蛋白。與野生種質相比，花蕾期和開花期栽培品種ABA信號轉導途徑中絕大多數基因表達量上調，其中，ABI基因表達量分別上調4.42和3.66倍。對9個栽培品種和5份野生種質的ABI基因進行PCR擴增，發現14份材料的405個位點中多態位點為30個，9個栽培品種間僅含1個多態位點，5個野生種質間含有7個多態位點，說明普通蕎麥ABI基因序列高度保守。栽培品種與野生種質ABI序列存在11個共同氨基酸差異位點，蛋白構象預測發現第32位點和第60位點氨基酸發生置換導致蛋白構象發生變化，表明其可能與栽培馴化過程中蕎麥喪失休眠與落粒特性相關。

普通蕎麥；脫落酸不敏感基因；序列分析；蛋白結構

蕎麥(Fagopyrum)起源于中國西南地區，包含普通蕎麥(F.esculentum)和韃靼蕎麥(F.tatricum)兩個主要的栽培種[1-2]。蕎麥的營養成分豐富、賴氨酸含量高、且富含黃酮類化合物，特別是蘆丁，具有降血糖、降血脂和降血壓等療效[1-4]。早在1946年，Couch等就提出將蕎麥作為蘆丁提取的主要來源作物[5]。普通蕎麥(common buckwheat)，又名甜蕎，是我國重要的小宗作物。在歷史上，蕎麥一直被用作救災糧食作物，具有生育期短、耐逆性強等特性，尤其是在抗寒、抗旱、抗病和耐貧瘠等方面表現較好[1-3]。野甜蕎(F.esculentumssp.ancestralis)與甜蕎相似，且能與甜蕎雜交結實，因此被認為是甜蕎的祖先[1-2]。不過，野甜蕎具有強烈的種子休眠特性，而且種子成熟過程中果實易脫落，這是利用野甜蕎與栽培甜蕎進行雜交育種所必須克服的兩個表型特征[1，3]。

脫落酸是植物生長過程中的重要信號分子，對種子休眠與果實脫落具有重要調控作用[6-9]。植物脫落酸不敏感(abscisic acid insensitive，ABI)家族蛋白是調控ABA信號途徑的重要轉錄調控因子[10-11]。通過對擬南芥等模式植物的研究發現，ABI1、ABI2屬于PP2C(protein phosphatase 2C)家族成員，abi1和abi2突變體都表現出對ABA高度敏感，證實ABI1、ABI2蛋白在ABA信號轉導途徑中起負調控作用[12-13]。ABI3、ABI4和ABI5則屬于bZIPs(basic leucine zippers)家族成員，ABI3蛋白參與調控儲藏物質的積累、種子干燥性以及誘導種子休眠；ABI4通過誘導ABA途徑相關基因表達，參與調控植物的生長和發育；ABI5則是ABA信號轉導的關鍵保守靶位點，調控ABA信號轉導和逆境脅迫反應，同時，ABI3還可與ABI5相互作用，激活ABA響應元件(ABRE/RY)介導的基因轉錄過程[14-16]。目前，尚無有關蕎麥ABI基因的相關研究報道。因此，本試驗通過對轉錄組基因測序所得的數據庫進行篩選，獲得蕎麥ABI的Unigene序列，設計特異性引物，進行PCR擴增、測序，分析普通蕎麥栽培品種與野生種質間基因序列的差異，以期為蕎麥ABI基因功能研究與蕎麥種子休眠、落粒以及起源與進化等相關研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用9個普通蕎麥栽培品種與5個具有休眠性和落粒性的野生種質(貴州師范大學蕎麥產業技術研究中心提供)為材料(表1)。苗期對植株進行取樣，用液氮迅速冷卻后儲存于-80 ℃冰箱，供樣品DNA的提取。花蕾期和開花期對植株花梗進行取樣，用液氮迅速冷卻后儲存于-80 ℃冰箱，供樣品RNA的提取。

1.2 轉錄組測序

使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)對花蕾期和開花期植株樣品進行RNA提取。將質量檢查合格的RNA樣品送由百邁客生物科技有限公司進行轉錄組測序。RNA提取操作步驟、轉錄組的測序與組裝參考石桃雄等[17]的方法。

1.3 PCR擴增與測序

對轉錄組基因測序所得到數據庫進行Unigene篩選，獲得蕎麥ABI的Unigene序列片段。利用軟件Primer5.0設計蕎麥ABIUnigene的正向特異性引物5’-TGTGGGGAAACCATTGAGTAG-3’和反向特異性引物5’-CATGTTTTGCTGTGGATGATG-3’。改良CTAB法提取樣品的DNA，操作步驟參考梁成剛等[18]方法。PCR反應體系體積為60 μL (包含30.0 μL 2×TaqPCR Master Mix、9.0 μL 40 ng·μL-1DNA模板、6.0 μL 5 μmol·L-1引物和9.0 μL ddH2O)。PCR擴增反應設置： 94 ℃預變性10 min；94 ℃變性60 s，55.6 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環35次；72 ℃延伸10 min。PCR擴增結束后，將產物置于瓊脂糖凝膠電泳檢測后送由生工生物工程(上海)有限公司測序。

表1 試驗材料

Table 1 The materials used in this study

代碼Code材料Materials休眠性Dormancy落粒性Shattering收集地OriginC1榆林甜蕎Yulincommonbuckwheat弱Weak弱Weak陜西ShaanxiC2赤甜1號Chitian1弱Weak弱Weak內蒙古InnerMongoliaC3寧蕎1號Ningqiao1弱Weak弱Weak寧夏NingxiaC4信農1號Xinnong1弱Weak弱Weak寧夏NingxiaC5定甜2號Dingtian2弱Weak弱Weak甘肅GansuC6平蕎2號Pingqiao2弱Weak弱Weak甘肅GansuC7威甜1號Weitian1弱Weak弱Weak貴州GuizhouC8綜甜1號Zongtian1弱Weak弱Weak貴州GuizhouC9自花甜蕎Zihuatianqiao弱Weak弱Weak貴州GuizhouWT1野甜蕎1Yetianqiao1強Strong強Strong西藏TibetWT2野甜蕎2Yetianqiao2強Strong強Strong云南YunnanWT3野甜蕎3Yetianqiao3強Strong強Strong云南YunnanWT4野甜蕎4Yetianqiao4強Strong強Strong四川SichuanWT5野甜蕎5Yetianqiao5強Strong強Strong—

“—”代表采集地不詳。

— represents the origin is unknown.

1.4 序列分析與進化樹的構建

使用網絡數據庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)的Nucleotide BLAST功能進行序列的在線比對。將序列對齊分值大于100，序列同一性大于65%的基因序列定義為高度同源。使用DNAsp5軟件進行序列差異分析，使用MEGA5.05軟件進行ClustalW序列比對分析和聚類分析，使用網頁(https://swissmodel.expasy.org/interactive)的Swiss-model功能進行蛋白結構預測。

2 結果與分析

2.1 蕎麥ABI基因序列

對蕎麥轉錄組基因測序構建的數據庫進行Unigene篩選，獲得蕎麥ABI的Unigene序列(CL38501)。生物信息學分析發現，該基因cDNA序列全長963 bp，其中堿基A占32.2%、T占23.7%、G占25.4%、C占18.7%，編碼320個氨基酸。從圖1可知，cDNA編碼的氨基酸具有典型的bZIP結構域。在線BLASTp比對結果發現，甜蕎ABI蛋白片段序列與葡萄Vitisvinifera等數十個物種、上百個ABI家族蛋白片段序列相似度高于65%，屬于高度同源。同時，從圖1還可以發現，cDNA編碼的氨基酸還具有ABI5家族保守區Ⅱ(CRⅡ)，因此，推測該Unigene可能編碼ABI5家族蛋白。

2.2 蕎麥ABI基因序列的PCR擴增

提取普通蕎麥9個栽培品種和5個野生種質植株的DNA，設計ABI基因的特征引物，進行PCR擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，14個供試材料中PCR擴增得到的產物在約400～500 bp處產生特異性條帶；測序結果發現，C1中產生的特異條帶序列片段為442 bp(圖2-A)。在蕎麥轉錄組基因測序(登錄號：SRS1350375)的數據庫中對C1測序獲得片段進行Nucleotide blast對比分析，結果發現該片段部分序列與蕎麥ABI基因cDNA片段部分序列的相似性達到99.5%(圖2-B)，說明PCR擴增產物即為蕎麥ABI基因片段。利用MEGA5.05軟件對該片段的蛋白序列進行系統進化分析，從聚類圖可知，蕎麥ABI序列與葡萄Vitisvinifera、蘋果Malusdomestica、梅花Prunusmume、歐洲草莓Fragariavesca、麻風樹Jatrophacurcas、胡楊Populuseuphratica等ABI序列差異較小，被聚在一起，親緣關系較近(圖3)。

單下劃線標記氨基酸序列為ABI5家族蛋白保守區Ⅱ；雙下劃線標記氨基酸序列為bZIP結構域Single underline marks for the amino acid sequence of conservative region Ⅱ of ABI5 family; Double underline marks for the amino acid sequence of bZIP domain圖1 蕎麥ABI Unigene的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 The cDNA and its coding amino acid sequence of buckwheat ABI Unigene

2.3 普通蕎麥ABI基因序列差異分析

利用MEGA5.05軟件中ClustalW對14個供試材料擴增得到的ABI基因片段序列進行多重比較分析，去掉序列兩端缺失導致排列不整齊的位點，對其中405個位點進行多態性統計，結果發現在14個供試材料中該基因序列片段的不變位點為375個，多態位點為30個(包含簡約信息位點數27個)。其中，在9個栽培品種間多態位點僅為1個，無簡約信息位點；5個野生材料間多態位點為7個(包含簡約信息位點數1個)。

M: Marker圖2 普通蕎麥PCR擴增產物(A)及其序列比對分析(B)Fig.2 The PCR amplification product (A) of common buckwheat DNA and its sequence analysis (B)

圖3 不同植物ABI氨基酸序列的聚類分析Fig.3 Phylogenetic tree of ABI amino acid sequence from different plant species

2.4 普通蕎麥ABI蛋白序列差異分析

利用ClustalW軟件對14個供試材料擴增得到ABI片段序列開放閱讀框(ORF)編碼的ABI氨基酸序列進行比較分析，結果發現9個普通蕎麥栽培品種的135個氨基酸位點中僅含1個差異位點，高度保守；5個野生種質含有4個差異位點，高度保守；栽培品種與野生種質間存在15個差異氨基酸位點，其中11個為共同差異位點(表2)。

表2 普通蕎麥栽培品種與野生種質間脫落酸不敏感蛋白的共同氨基酸差異位點

Table 2 The differential loci of amino acid sites of ABI between cultivar and wild-type of common buckwheat

材料Materials氨基酸位點Thesitesofaminoacid91617323343446063657797103125135榆林甜蕎YulintianqiaoSGQTAADESNLLEQH赤甜1號Chitian1SGQTAADESNLLEQH寧蕎1號Ningqiao1SGQTAADESNLLEQH信農1號Xinnong1SGQTAADESNLLEQQ定甜2號Dingtian2SGQTAADESNLLEQQ平蕎2號Pingqiao2SGQTAADESNLLEQQ威甜1號Weitian1SGQTAADESNLLEQH綜甜1號Zongtian1SGQTAADESNLLEQH自花甜蕎ZihuatianqiaoSGQTAADESNLLEQQ野甜蕎1Yetianqiao1NNHSGTGQCDFSDQH野甜蕎2Yetianqiao2NNHSGTGQCDLLDQH野甜蕎3Yetianqiao3NNHSGTGQCDLSDQH野甜蕎4Yetianqiao4NNHSGTGQCDFSDQH野甜蕎5Yetianqiao5NNHSGTGQCDLSDHR

利用網頁(https://swissmodel.expasy.org/interactive)的Swiss-model對擴增得到的ABI蛋白片段進行蛋白質結構在線預測，結果發現，栽培品種和野生種質間ORF蛋白結構存在明顯的構象差異。由圖4可知，栽培品種和野生種質間存在的11個氨基酸差異位點導致ORF區域蛋白的1個片段，β-片層和α-螺旋結構發生改變(圖4-A、B)。進一步對11個氨基酸差異位點發生單位點置換后進行蛋白質結構預測，結果發現其中9個位點的置換對蛋白空間結構沒有影響，但ORF第32位點T→S和第60位點E→Q發生轉換導致蛋白結構域發生構象變化(圖4-A、C、D)。

栽培品種(A)、野生種質(B)、栽培品種ABI蛋白第32位點T→S發生轉換(C)和第60位點E→Q發生轉換(D)的結構域；箭頭指向結構與栽培品種ABI蛋白結構發生改變的區域The protein conformation of cultivar (A)， wild germplasm (B)， the amino acid transformation at the 32nd (C) and 60th (D) sites of ABI. Arrows point to the changed protein conformation of ABI， as compared with that of cultivar圖4 普通蕎麥ABI蛋白片段結構域分析Fig.4 Analysis of the domain of ABI protein fragment of common buckwheat

2.5 普通蕎麥ABI基因表達差異分析

對栽培品種與野生種質的轉錄組基因測序結果進行分析發現，花蕾期和開花期栽培品種ABA信號途徑中PYR/PYL、PP2C、SnRK2和ABF家族絕大多數基因較野生種質表達量上調(圖5-A、B)。其中，花蕾期栽培品種ABI(CL38501)基因較野生種質表達量上調4.42倍，開花期較野生種質表達量上調3.66倍。

3 討論

植物ABA信號途徑在調控逆境脅迫應答、種子脫落和休眠等方面具有重要作用[9，19-20]。研究發現，ABA 能夠與 PYR/PYL受體作用，通過負調控作用調節蛋白磷酸酶PP2C活性，再調節下游SnRK2蛋白激酶活性，進而調節ABF蛋白活性[21-22]。ABI屬于ABF類家族蛋白，是調控ABA信號途徑的重要轉錄調控因子。ABI家族蛋白中ABI3、ABI4和ABI5屬于bZIP家族成員。本研究發現，蕎麥ABI的Unigene(CL38501)

圖5 花蕾期(A)和開花期(B)栽培品種與野生種質ABA信號途徑中基因的相對表達圖Fig.5 The relative expression map of genes involved in the ABA signal pathway of cultivar and wild-type of common buckwheat in the bud stage (A) and flowering stage (B)

序列cDNA全長為963 bp，編碼320個氨基酸，含有典型的bZIP結構域和ABI5家族保守區Ⅱ(圖1)，因此，推測該基因可能編碼ABI5家族蛋白。

蘇亮等[23]對ABI5蛋白序列進行聚類分析，發現水稻OsABI5-1和OsABI5-2序列高度保守，被聚在一起，玉米ZmABI5與高粱SbABI5聚在一起，其親緣關系近。本試驗通過PCR擴增獲得蕎麥ABI基因片段，序列分析發現5個野生種質405個位點中含有7個多態位點，9個栽培品種僅含1個多態位點，14份材料共含有30個多態位點，說明栽培馴化過程中該基因序列高度保守。聚類分析發現，蕎麥ABI序列與葡萄、蘋果、梅花、草莓、麻風樹、胡楊等ABI5-Like2序列差異較小，被聚在一起，推測蕎麥ABI基因可能編碼ABI5-Like2蛋白。

普通蕎麥栽培品種是由野甜蕎長期栽培馴化而來，現已不具備種子休眠與落粒等性狀[1]。對擬南芥、水稻和小麥等的研究發現，ABI5對種子成熟、休眠、萌發、幼苗生長和逆境應答等方面均有重要調控作用[8，24-25]。Yan等[26]研究發現，玉米葉片ZmABI5在鹽、水楊酸、脫落酸、高溫和低溫處理下表達量上調，在干旱和傷害處理下表達量下調；但玉米根ZmABI5在干旱、傷害、高溫和低溫處理下表達量上調，在鹽、水楊酸和脫落酸處理下表達量下調，說明ABI5調控ABA信號途徑的機制較為復雜。蘇亮等[23]利用cDNA-SRAP轉錄組分析證實ZmABI5基因與玉米磷脅迫反應有關。花蕾期和開花期對普通蕎麥栽培品種與野生種質進行轉錄組測序發現，栽培品種ABA信號轉導途徑中PYR/PYL、PP2C、SnRK2和ABF基因家族絕大多數基因表達量均上調。其中，ABI(CL38501)基因表達量較野生種質植株分別上調4.42和3.66倍。對蕎麥ABI蛋白片段進行序列分析發現，14個材料間存在15個差異氨基酸位點，而栽培品種和野生種質間存在11個共同差異氨基酸位點(表2)，栽培馴化對這11個差異氨基酸位點的選擇具有高度一致性。蛋白結構預測發現，栽培品種和野生種質間蛋白構象存在明顯差異。進一步分析發現，構象差異是由第32位點T→S和第60位點E→Q發生轉換導致(圖4-A、C、D)的，表明其可能與栽培馴化過程中甜蕎喪失休眠與落粒特性相關。本試驗結果為進一步研究蕎麥ABI基因功能以及栽培進化提供了理論基礎。

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(責任編輯 張 韻)

Sequence analysis of ABA-insensitive gene of common buckwheat，Fagopyrumesculentum

WANG Yan1， LIU Yao2， LIANG Chenggang1，*， CHEN Qingqing1， SHI Taoxiong1， CHEN Qijiao1， MENG Ziye1， CHEN Qingfu1

(1.ResearchCenterofBuckwheatIndustryTechnology，GuizhouNormalUniversity，Guiyang550001，China; 2.ShaanxiMicangshanNationalNatureReserve，Hanzhong723500，China)

ABA-insensitive (ABI) is a kind of transcription factors that regulates plant stress response， seed shattering and dormancy. Bioinformatic analysis indicated that the cDNA sequence of common buckwheatABI(CL38501) gene contained 963 bp， coded 320 amino acids including the bZIP domain and the conserved domain Ⅱ of ABI5， suggesting that it might encode the ABI5 family protein. The major genes involve in ABA signal transduction pathway were up-regulated in cultivar includingABIthat was up-regulated by 4.42-fold and 3.66-fold at bud stage and flowering stage， respectively， as compared with the wild germplasm of common buckwheat. A total of 405 sites inABIgene including 30 polymorphic sites were identified among 9 cultivars and 5 wild germplasms of common buckwheat. Only 1 polymorphic site was identified among 9 cultivars， whereas 7 polymorphic sites were identified in 5 wild germplasms. These results indicated that theABIsequence of common buckwheat was highly conserved. A total of 11 consistent polymorphic amino acid sites were identified among cultivar and wild germplasm. The change of protein conformation was found between cultivar and wild germplasm of common buckwheat induced by the amino acid transformation at the 32nd and 60th sites of ABI， implying that it might be associated with the loss of seed shattering and dormancy during the long domestication process.

common buckwheat; ABA-insensitive gene; sequence analysis; protein structure

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.02

2016-07-29

貴州省科技廳合作計劃項目(黔科合LH字[2015]7770號)；貴州師范大學資助博士科研項目(0516029)；貴州省“三區”人才工作專項經費(0515075)；國家自然科學基金面上項目(31471562)；國家燕麥蕎麥現代農業產業技術體系專項資金(CARS-08-A4)；貴州省蕎麥工程技術研究中心項目(黔科合農G字[2015]4003號)

汪燕(1985—)，女，重慶人，博士，助理研究員，從事作物遺傳育種與分子機制等相關研究。E-mail: yanwanguf@163.com

*通信作者，梁成剛，E-mail: jesselcg@163.com

S517；Q941+.2

A

1004-1524(2017)02-0186-07